黑樹莓再生體系的建立和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽基因轉(zhuǎn)化.pdf

1、本試驗(yàn)以黑樹莓(Rubus Eubatus L.)葉片、葉柄、節(jié)間莖段、破壞生長點(diǎn)的莖尖為外植體進(jìn)行再生芽的誘導(dǎo)，建立黑樹莓的再生體系．以MS為基本培養(yǎng)基，研究生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素不同配比對(duì)不同外植體再生率的影響，探索黑樹莓再生培養(yǎng)最適宜的激素配比以及最適宜的外植體．在再生體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行了黑樹莓遺傳轉(zhuǎn)化方面的探索，通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)高效載體介導(dǎo)黑樹莓破壞生長點(diǎn)的莖尖、節(jié)間葦段、葉

2、柄、葉片等外植體的轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)，將調(diào)節(jié)耐鹽基因、耐旱基因、抗氧化基因等抗逆基因表達(dá)的調(diào)控基因HS轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入其中，得到轉(zhuǎn)化植株。論文的研究結(jié)果如下： 1.以黑樹莓、八棱海棠(M. robusta)為材料，對(duì)其組培苗進(jìn)行不同培養(yǎng)基、不同鹽濃度的脅迫處理，經(jīng)過60大觀察，黑樹莓在不同鹽濃度的1/2MS培養(yǎng)基里耐鹽能力為0.4％左右，八棱海棠的耐鹽能力為0.2％左右，在MS培養(yǎng)基里黑樹莓的耐鹽能力為0.6％左右；在MS+1BA+0.

3、1NAA+"2GA培養(yǎng)基里黑樹莓的耐鹽能力為0.8％左右。 2.以黑樹莓葉片、葉柄、節(jié)間莖段、破壞生長點(diǎn)的莖尖為外植體進(jìn)行再生芽的誘導(dǎo)，以MS為基本培養(yǎng)基，2，4.D、NAA、IBA、IAA、6-BA、KT、GA不同配比對(duì)再生率的影響，得出黑樹莓葉柄、節(jié)間葦段、破壞生長點(diǎn)的莖尖在6-BA0.5-6mg/L和NAA0.05-0.5mg，L均有不同程度的再生．說明在一定范圍內(nèi)，黑樹莓對(duì)激素的要求不是很嚴(yán)格，不同配比均可再生。MS+6

4、-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+GA2mg/L為黑樹莓最適宜的分化再生培養(yǎng)基。通過對(duì)不同黑樹莓外植體葉片、葉柄、節(jié)間萃段、破壞生長點(diǎn)的莖尖等在相同培養(yǎng)條件下分化再生率比較分析，得出黑樹莓離體再生培養(yǎng)最適宜的外植體類型為破壞生長點(diǎn)的莖尖，其死亡率低、分化出芽快且分化率高。莖段與葉柄切口處也有芽的分化再生，在材料較少的情況下，利用莖段、葉柄作為外植體也是適宜的。 3.黑樹莓試管苗生根比較容易，不加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基即

5、可誘導(dǎo)生根，但是所生根比較細(xì)弱，NAA對(duì)黑樹莓生根效果顯著，黑樹莓的最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA0.1mg/L。 4.通過不同除草劑濃度篩選得出黑樹莓轉(zhuǎn)化篩選的除草劑壓力濃度為4mg/L，生根培養(yǎng)的壓力濃度為6mg/L。 5.通過不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)方式、共培養(yǎng)基等比較處理，篩選出最適宜的轉(zhuǎn)化條件為將在分化培養(yǎng)基MS+6-BA2mg/L+NAA0.1 mg/L+GA2mg/L上預(yù)培養(yǎng)2d

6、后的葉片、葉柄、莖段和破壞生長點(diǎn)的莖尖作為外植體，用OD5500.4的農(nóng)桿菌侵染12min，接種于MS+6-BA2.0mg/L+-NAA0.1mg，L+GA2mg/L+AS100μm/L，暗處共培養(yǎng)三天，轉(zhuǎn)接于MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/LL+4mg/L除草劑+500mg/L羧芐青霉素中，通過篩選獲得的抗性芽為轉(zhuǎn)基因突變體。待轉(zhuǎn)化芽長到高于1.5cm時(shí)，轉(zhuǎn)入添加除草劑的生根培養(yǎng)基MS+NAA0.1 mg/L+6mg/ml

7、除草劑+500mg/L羧芐青霉素中進(jìn)行生根培養(yǎng)。35d左右即可移栽到無菌基質(zhì)中。 6.通過不同移栽條件的比較處理得出黑樹莓抗性苗最有利的移栽措施為：將生根的黑樹莓轉(zhuǎn)化苗從培養(yǎng)箱中取出，室溫下煉苗3天，去掉根部培養(yǎng)基，并用無菌水沖洗干凈后移入滅過菌的蛭石培養(yǎng)杯中；在室溫下培養(yǎng)7d，澆蒸餾水，保濕避免陽光直射； 7d后移入帶有保濕裝置的培養(yǎng)杯、澆蒸餾水，在太陽光散射下培養(yǎng)；14d后逐漸去掉保濕裝置，在太陽光直射光下進(jìn)行培養(yǎng)，待其長出