新的細(xì)胞壁錨定蛋白SasX在金黃色葡萄球菌定植和感染中的作用及其作為疫苗靶點(diǎn)可行性的初步研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌作為重要的致病菌，主要引起皮膚膿腫、菌血癥、致死性肺炎和化膿性心內(nèi)膜炎等。金黃色葡萄球菌同時(shí)也能以定植菌的形式，持續(xù)或者暫時(shí)存在于約10-30％的人群中，當(dāng)宿主皮膚破損或免疫力低下時(shí)遷移至適當(dāng)?shù)奈恢枚l(fā)感染。19世紀(jì)60年代出現(xiàn)了被稱為“超級(jí)細(xì)菌”的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA以來，金黃色葡萄球菌日益嚴(yán)重的耐藥情況使得對(duì)于其感染的治療成了臨床醫(yī)生一大棘手的問題。研發(fā)新的抗金黃色葡萄球菌的藥物或者疫苗迫在眉睫，發(fā)現(xiàn)新的

2、有效藥物或者疫苗的靶點(diǎn)已經(jīng)成為了目前國際研發(fā)的新熱點(diǎn)。
　　金黃色葡萄球菌的表面表達(dá)多種功能各異的蛋白，它們通常以共價(jià)的形式錨定在金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的肽聚糖上，因此這些表面蛋白被稱為細(xì)胞壁錨定蛋白。近年來多個(gè)研究報(bào)道證實(shí)了多種細(xì)胞壁錨定蛋白在金黃色葡萄球菌的定植和感染中起到重要作用。因?yàn)楸磉_(dá)于金黃色葡萄球菌的表面，細(xì)胞壁錨定蛋白不僅易于被藥物分子或者抗體接觸，而且大多為細(xì)菌的重要毒力因子，因此常常成為藥物或者疫苗研發(fā)的新靶點(diǎn)。<

3、br>　　MRSA ST239克隆株在中國以及亞洲其它國家醫(yī)院環(huán)境內(nèi)廣泛流行。我們通過基因組比對(duì)研究發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞壁錨定蛋白，它與表皮葡萄球菌的毒力因子SesⅠ同源性極高。通過已有的對(duì)于SesⅠ的研究報(bào)道，我們推測(cè)MRSA ST239克隆株中的這一新的細(xì)胞壁錨定蛋白可能在MRSA ST239菌株在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)的持續(xù)感染中發(fā)揮重要的作用。我們將其命名為SasⅩ(Staphylococcus aureus surfaceproteinⅩ)

4、。本研究希望通過對(duì)這一新的細(xì)胞壁錨定蛋白SasⅩ在金黃色葡萄球菌中的分布特點(diǎn)、在定植和感染中的作用以及其作為疫苗研發(fā)新靶點(diǎn)的可行性進(jìn)行研究，以期能夠明確MRSA ST239在醫(yī)院內(nèi)持續(xù)感染的分子機(jī)制，為抗金黃色葡萄球菌感染的新藥物或疫苗提供可能的研發(fā)靶點(diǎn)。
　　(1)新的細(xì)胞壁錨定蛋白SasⅩ的發(fā)現(xiàn)及其編碼基因在金黃色葡萄球菌中的分布
　　在中國以及亞洲其它國家醫(yī)院環(huán)境內(nèi)廣泛流行的MRSA克隆株為ST239菌株。通過對(duì)其基因

5、組的比對(duì)分析，我們發(fā)現(xiàn)了一段新的細(xì)胞壁錨定蛋白編碼序列，將其編碼的蛋白命名為SasⅩ。 SasⅩ與表皮葡萄球菌SesⅠ氨基酸同源性高達(dá)95％，通過對(duì)SesⅠ蛋白功能的研究，我們推測(cè)SasⅩ蛋白可能在金黃色葡萄球菌ST239克隆株在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)持續(xù)感染中起到重要作用。本部分首先應(yīng)用分子流行病學(xué)方法對(duì)sasⅩ基因進(jìn)行分析。隨機(jī)收集中國華東地區(qū)三家教學(xué)醫(yī)院從2003年至2011年間共807株金黃色葡萄球菌菌株和來自社區(qū)健康人鼻腔定植的金黃色葡萄

6、球菌菌株170株進(jìn)行了sasⅩ基因的擴(kuò)增分析，發(fā)現(xiàn)sasⅩ主要存在于醫(yī)院環(huán)境內(nèi)致病性的金黃色葡萄球菌中，而在健康人鼻腔內(nèi)分離的金黃色葡萄球菌中sasⅩ的陽性率為0.59％。sasⅩ在ST239菌株中的陽性率持續(xù)上升，在其他克隆株中也逐漸出現(xiàn)sasⅩ陽性的菌株，如ST5、ST88等。通過對(duì)不同sasⅩ陽性的不同的克隆株中sasⅩ周圍基因環(huán)境的分析發(fā)現(xiàn)sasⅩ基因均存在于φSPβ樣原噬菌體中，這一結(jié)果提示攜帶sasⅩ基因的φSPβ樣原噬菌體

7、可以在不同克隆株之間傳播，從2003年-2005年至2009年-2011年，攜帶sasⅩ基因的MRSA比率從26.9％上升至45.2％，而攜帶sasⅩ基因的MSSA的比率只約占10％。通過分析臨床分離的sasⅩ陽性和sasⅩ陰性金黃色葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性差異提示sasⅩ基因的存在可能與細(xì)菌的耐藥有關(guān)。本部分的研究結(jié)果顯示，SasⅩ是金黃色葡萄球菌在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)持續(xù)感染的毒力因子之一，sasⅩ可能在細(xì)菌的致病力中起到重要的作用。

8、>　　(2) SasⅩ在金黃色葡萄球菌生物膜形成和致病中的作用分析
　　采用基因敲除及基因互補(bǔ)技術(shù)獲得MRSA ST239 HS770菌株、HS605菌株和MRSA ST5 HS72菌株的sasⅩ基因敲除株及基因互補(bǔ)株。應(yīng)用半定量生物膜形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sasⅩ基因敲除前后對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響，與野生株相比，sasⅩ基因敲除株生物膜形成能力明顯減弱。在進(jìn)一步的初始粘附實(shí)驗(yàn)中，sasⅩ基因敲除株粘附能力明顯減弱。SasⅩ可以通

9、過影響細(xì)菌的初始黏附從而影響生物膜的形成。使用小鼠的皮膚膿腫形成模型和肺炎模型研究SasⅩ對(duì)金黃色葡萄球菌毒力的影響。在小鼠皮膚膿腫形成模型中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示sasⅩ基因敲除前后均能引起小鼠皮膚膿腫的形成，但sasⅩ基因野生株接種小鼠皮膚膿腫形成面積在同一時(shí)間點(diǎn)上明顯大于sasⅩ基因敲除株，證明SasⅩ在小鼠皮膚膿腫中起到重要的作用;在小鼠肺炎模型中，sasⅩ基因野生株與其相應(yīng)的敲除株相比較在濕肺組織/體重比值、由檢測(cè)TNF-α水平而鑒定

10、的肺組織中引起炎癥程度及病理切片觀察肺組織病變程度的結(jié)果均證明了SasⅩ在小鼠肺炎感染中起到一定的作用。細(xì)菌對(duì)于免疫系統(tǒng)的逃逸能力與其致病性密切相關(guān)，而中性粒細(xì)胞是機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的主要效應(yīng)細(xì)胞。sasⅩ基因敲除株比起其相應(yīng)的攜帶有sasⅩ基因的臨床菌株具有更高的被中性粒細(xì)胞吞噬的機(jī)率。對(duì)于吞噬過程的研究顯示，野生株具有明顯的溶胞作用。sasⅩ基因能夠幫助細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷，促進(jìn)細(xì)菌的致病性。
　　(3) SasⅩ在金黃色

11、葡萄球菌粘附聚集和定植中的作用分析
　　SasⅩ在生物膜形成中的作用提示SasⅩ可能在金黃色葡萄球菌的粘附聚集能力中起到重要的作用。使用普通顯微鏡直接觀察sasⅩ基因敲除前后細(xì)菌自身的粘附聚集能力發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，sasⅩ基因敲除株自身的聚集能力明顯減弱，而互補(bǔ)表達(dá)株的自身聚集能力與野生株無明顯差異。金黃色葡萄球菌對(duì)于人類鼻腔表皮細(xì)胞的粘附在細(xì)菌的定植、播散和致病中有著重要的影響，鼻腔是金黃色葡萄球菌在人體中重要的定植部位。通過

12、粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sasⅩ基因突變前后對(duì)金黃色葡萄球菌粘附至人體鼻腔上皮細(xì)胞的能力，并通過阻斷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)純化的SasⅩ蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌粘附至人體鼻腔上皮細(xì)胞的阻斷能力，從而分析SasⅩ蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌定植能力的影響。結(jié)果顯示，與野生株相比，突變株粘附至人體鼻腔上皮細(xì)胞能力明顯減弱，互補(bǔ)表達(dá)株粘附能力則明顯增強(qiáng)。表達(dá)純化的GST融合蛋白SasⅩ和人體鼻腔上皮細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)對(duì)于野生株粘附至人體鼻腔上皮細(xì)胞的能力具有明顯的抑制作用。作為鼻腔

13、定植的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，小鼠鼻腔定植模型的結(jié)果顯示ST239和ST5的sasⅩ基因敲除株在小鼠鼻腔內(nèi)的定植能力比起其相應(yīng)的野生株明顯下降。在sasⅩ基因野生株和基因敲除株的定植競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)也顯示sasⅩ基因敲除株的定植能力明顯弱于野生株。研究結(jié)果表明，新的細(xì)胞壁錨定蛋白SasⅩ影響金黃色葡萄球菌粘附聚集和定植能力，金黃色葡萄球菌通過獲得sasⅩ基因更加容易定植到宿主易感部位，進(jìn)而引發(fā)感染。
　　(4) SasⅩ作為金黃色葡萄球菌疫苗靶點(diǎn)可行性

14、的初步研究
　　通過對(duì)SasⅩ蛋白功能的研究結(jié)果顯示，這一新的細(xì)胞壁錨定蛋白是金黃色葡萄球菌的重要毒力因子。本部分以SasⅩ作為靶點(diǎn)通過主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫方式展開研究，以初步探索其是否具有成為研發(fā)抗金黃色葡萄球菌感染疫苗有效靶點(diǎn)的可行性。在小鼠的主動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)中，我們使用純化的SasⅩ重組蛋白與弗氏佐劑乳化后制成的疫苗免疫小鼠，對(duì)其血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有高滴度的抗SasⅩ抗體產(chǎn)生，這說明SasⅩ蛋白具有很好的免疫原性，可以使被免疫小鼠產(chǎn)

15、生特異性的免疫應(yīng)答。使用不完全佐劑加強(qiáng)免疫一周后特異性抗體滴度達(dá)到最高。特異性抗體第一次免疫后一周以IgG2a和IgG2b為主，不完全佐劑加強(qiáng)免疫一周IgG1升高成為濃度比例最高的抗體亞型。通過小鼠皮膚膿腫模型、小鼠肺炎模型以及小鼠菌血癥模型三個(gè)動(dòng)物體內(nèi)模型顯示:以純化的SasⅩ蛋白與弗氏佐劑制成的疫苗免疫小鼠后，產(chǎn)生的特異性抗體具有明顯的免疫保護(hù)作用，組織炎癥反應(yīng)及損傷程度和感染死亡率明顯降低。使用純化的SasⅩ重組蛋白與弗氏佐劑制成

16、的疫苗免疫兔子后，成功純化獲得含有抗SasⅩ的總IgG，用其進(jìn)行的動(dòng)物被動(dòng)免疫體內(nèi)試驗(yàn)顯示:較SasⅩ蛋白主動(dòng)免疫動(dòng)物相比，使用抗SasⅩ蛋白抗體被動(dòng)免疫動(dòng)物后抗感染能力與對(duì)照組未見顯著差異。所制備多抗的低活性是這一結(jié)果可能的原因之一。另外還需要增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量以更好地評(píng)估抗SasⅩ多克隆抗體在免疫保護(hù)中的作用。該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示SasⅩ蛋白作為金黃色葡萄球菌疫苗靶點(diǎn)具有一定的可能性，對(duì)這一新的細(xì)胞壁錨定蛋白在疫苗中的應(yīng)用具有進(jìn)一