丙烯酰胺對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的損傷及鈣蛋白酶抑制劑的干預(yù).pdf

1、丙烯酰胺(acrylamide，ACR)是國際上確認(rèn)的一種神經(jīng)毒物，其中毒患者主要是生產(chǎn)和使用單體的作業(yè)者，中毒表現(xiàn)尤其易出現(xiàn)在通風(fēng)不良和缺乏個(gè)人防護(hù)的工作條件下。在ACR(如丙烯酰胺生產(chǎn)、聚丙烯酰胺合成、污水處理、石油開采、建筑工程灌漿等)的職業(yè)接觸人群中，職業(yè)性損害主要表現(xiàn)為皮膚損害以及神經(jīng)系統(tǒng)損害，神經(jīng)系統(tǒng)損害又包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CentralNervousSystem，CNS)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PeriPheralnervousS

2、ystem，PNS)損害。90％的ACR單體用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺(Polyaeryhmide，PACR)，近年來，石油工業(yè)發(fā)展迅速，PACR的需求量隨之不斷增加，因而ACR需求量隨之不斷增加，危害越來越大，對(duì)ACR的研究相應(yīng)越來越多。但有關(guān)ACR神經(jīng)毒作用的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未完全闡明。有學(xué)者認(rèn)為ACR中毒是由軸漿運(yùn)輸損傷引起的。細(xì)胞骨架在軸漿運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用，ACR通過作用于軸突細(xì)胞骨架蛋白的不同成分而影響軸漿運(yùn)輸，從而導(dǎo)致遠(yuǎn)端軸突功

3、能改變，導(dǎo)致神經(jīng)損傷。而細(xì)胞骨架蛋白聚集或降解可能是由鈣離子依賴性蛋白酶(Calpain)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白分解引起的。Calpain通過影響骨架蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。目前認(rèn)為，CNS損傷后細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平升高，可增強(qiáng)Calpain活性，選擇性降解髓磷脂蛋白及多種細(xì)胞骨架蛋白。有學(xué)者應(yīng)用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后Calpain的表達(dá)增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中選擇神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)進(jìn)行離體研究

4、，NSCs具有多向分化潛能，在研究神經(jīng)系統(tǒng)毒性時(shí)具有代表性;能進(jìn)行自我增殖，可提供實(shí)驗(yàn)所需的大量細(xì)胞。自出生24h內(nèi)的Wistar新生大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DorsalRootGanglion，DRG)獲取原代細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，獲取穩(wěn)定的細(xì)胞株。然后進(jìn)行細(xì)胞ACR染毒，用噻唑蘭比色法(MTT)法測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率以建立ACR對(duì)NSCs損傷的染毒模型，在此模型的基礎(chǔ)上用鈣蛋白酶抑制劑MDL-28170進(jìn)行干預(yù)，建立干預(yù)模型。通過測(cè)定

5、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及Calpain活性進(jìn)一步確定鈣蛋白酶抑制劑對(duì)ACR誘發(fā)NSCs毒性的干預(yù)作用。
　　目的
　　1.本實(shí)驗(yàn)建立ACR對(duì)NSCs的損傷模型，通過Calpain抑制劑MDL-28170抑制Calpain的活性達(dá)到抑制ACR引起的NSCs損傷的目的。
　　2.測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及Calpain活性，進(jìn)一步確定ACR對(duì)NSCs的損傷及鈣蛋白酶抑制劑對(duì)這種損傷的干預(yù)作用，為后續(xù)研究神經(jīng)絲蛋白(Neurofila

6、ment，NF)變化機(jī)制、預(yù)防ACR暴露工人的NSCs損傷提供參考。
　　方法
　　1.無菌條件下摘取出生24h內(nèi)新生大鼠的DRG，胰蛋白酶消化后進(jìn)行接種，通過細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測(cè)巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NeuronSpecificEnolase，NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein，GFAP)三個(gè)指標(biāo)，以確認(rèn)所培養(yǎng)細(xì)胞為NSCs。進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，獲

7、取穩(wěn)定的細(xì)胞株。
　　2.對(duì)建立的細(xì)胞株進(jìn)行ACR的染毒和MDL-28170干預(yù)劑量篩選，用MTT法測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率來確定染毒劑量和染毒持續(xù)時(shí)間，建立細(xì)胞染毒及干預(yù)模型。
　　3.使用Fura-2/AM探針和calpainsubstratell分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及Calpain活性。
　　結(jié)果
　　1.原代細(xì)胞的獲取及鑒定
　　細(xì)胞免疫化學(xué)染色，NSCs的標(biāo)志性蛋白Nestin染色呈陽性，

8、而且相同來源的細(xì)胞可誘導(dǎo)分化成NSE陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.染毒及干預(yù)模型的建立
　　(1)ACR的染毒濃度為0、1400、2800、4200、5600μmol/L，染毒24小時(shí)后，自2800μmol/LACR染毒組開始與對(duì)照組細(xì)胞存活率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;染毒48小時(shí)后，自1400μmol/LACR染毒組開始與對(duì)照組細(xì)胞存活率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。根據(jù)上述結(jié)果ACR24小時(shí)染毒

9、劑量調(diào)整為0、2240、2520、2800、3080μmol/L后，染毒后細(xì)胞存活率自2240μmol/LACR染毒組開始與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);48小時(shí)ACR染毒劑量調(diào)整為0、700、840、980、1120、1400μmol/L，染毒后細(xì)胞存活率自700μmol/LACR染毒組開始與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。24小時(shí)染毒劑量為0、1050、1400、1750、2100μmol/L時(shí)，染毒后細(xì)胞存活率自21

10、00μmol/LACR染毒組開始與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);48小時(shí)染毒劑量調(diào)整為0、140、350、560、700μmol/L，染毒后細(xì)胞存活率自700μmol/LACR染毒組開始與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。2100μmol/L染毒24小時(shí)與700μmol/L染毒48小時(shí)可定為實(shí)驗(yàn)染毒劑量和染毒持續(xù)時(shí)間。
　　(2)ACR染毒的濃度和染毒持續(xù)時(shí)間分別為2100μmol/L染毒24小時(shí)與700μmol/L染

11、毒48小時(shí)，同時(shí)鈣蛋白酶抑制劑以65、130、195、260μmol/L的濃度進(jìn)行干預(yù)。
　　24小時(shí)干預(yù)結(jié)果:所有染毒、干預(yù)組的細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。65、130μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率高于染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);195、260μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率低于染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　48小時(shí)干預(yù)結(jié)果:染毒、干預(yù)組的細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組，差異

12、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。65、130μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率高于染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);195μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率與染毒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);260μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率低于染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定結(jié)果
　　與對(duì)照組相比:染毒組的鈣離子濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);干預(yù)組鈣離子濃度平均值高于對(duì)照組，但差

13、異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與染毒組相比:干預(yù)組鈣離子濃度低于染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.Calpain活性測(cè)定結(jié)果
　　與對(duì)照組相比:染毒組的Caipain活性高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);干預(yù)組Calpain活性高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。與染毒組相比:干預(yù)組Calpain活性低于染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　1.成功