河北省蘋果樹腐爛病菌種類分析及分子檢測體系的建立.pdf

1、河北省是我國蘋果生產(chǎn)大省，蘋果樹腐爛病在我國各蘋果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，經(jīng)常造成毀園，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，河北省腐爛病菌種類尚不明確，且缺乏診斷無癥狀樹體是否帶菌的準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法。本研究通過對(duì)ITS基因序列進(jìn)行分析，初步明確了河北省蘋果樹腐爛病菌的種類和系統(tǒng)進(jìn)化情況;建立了蘋果樹腐爛病菌巢氏PCR檢測體系，初步揭示未顯癥果樹帶菌組織部位及顯癥果樹病疤周圍帶菌情況。為蘋果樹腐爛病準(zhǔn)確診斷和有效防治提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:

2、r>　　1、明確了河北省蘋果樹腐爛病菌的種類。以采自河北省9個(gè)市12個(gè)縣（區(qū)）的具有不同菌落顏色的31株腐爛病菌為研究對(duì)象，采用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析河北蘋果樹腐爛病菌種類。31株腐爛病菌菌株rDNA-ITS序列長度范圍為542～563 bp，Blast分析表明，20株為Valsaceratosperma，11株為Valsa mali var.mali，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明河北

3、省蘋果樹腐爛病菌全部與Valsa mali var.mali，Valsa mali和Valsa cerastosperma聚在同一分支，屬于同一種群。證明了供試河北省蘋果樹腐爛病菌為Valsa mali。
　　2、建立了蘋果樹腐爛病菌巢氏PCR檢測體系。首先通過比較改良CTAB法、快速鹽提法、試劑盒法提取DNA濃度、純度、電泳及PCR擴(kuò)增效果，確定了適合蘋果組織帶菌檢測的DNA提取方法。通過引物的設(shè)計(jì)、引物特異性測定、擴(kuò)增體系的優(yōu)

4、化、靈敏度測定、可靠性驗(yàn)證構(gòu)建了蘋果樹腐爛病菌的巢氏PCR檢測體系。結(jié)果表明，改良CTAB法提取DNA的濃度為102.1～734.5 ng/μL，A260/A280為2.06～2.29，電泳后有大于2000 bp的條帶，隨機(jī)引物進(jìn)行PCR獲得了清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，是較適合蘋果樹木質(zhì)部和韌皮部組織基因組DNA提取的方法。建立的巢氏PCR檢測體系將真菌通用引物ITS1/ITS4作為第一輪擴(kuò)增引物，蘋果樹腐爛病菌ITS區(qū)特異引物V-F/V-R

5、作為第二輪擴(kuò)增引物，檢測靈敏度達(dá)到了1fg/μL，能夠用于蘋果樹腐爛病田間樣本檢測。為蘋果樹腐爛病準(zhǔn)確診斷提供了可靠的方法，為病害防治奠定基礎(chǔ)。
　　3、揭示了無明顯癥狀發(fā)病蘋果樹不同組織部位攜帶腐爛病菌情況，顯癥果樹不同類型病斑周圍帶菌情況。通過對(duì)不顯癥蘋果樹主干、3年生枝條、2年生枝條、1年生枝條的韌皮部和木質(zhì)部組織進(jìn)行帶菌情況的檢測，發(fā)現(xiàn)不顯癥蘋果樹韌皮部組織帶菌率較高，達(dá)60％，而木質(zhì)部組織帶菌率低，僅為5％。枝條的生長時(shí)