低溫脅迫下不同倍性西瓜基因的差異表達(dá)及表觀遺傳研究.pdf

1、西瓜(Citrullus lanatus)是夏季主要的消暑果品，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于西瓜本身是一種喜溫耐熱性作物，所以對(duì)低溫環(huán)境比較敏感。雖然在設(shè)施栽培中利用溫室大棚、地膜覆蓋等技術(shù)滿足西瓜生長(zhǎng)所需適宜溫度，但仍會(huì)受到低溫的傷害，而且目前西瓜的耐冷性種質(zhì)資源十分匱乏，急需解決西瓜的耐冷性問(wèn)題。在生理生化方面已有研究發(fā)現(xiàn)西瓜多倍體耐冷性強(qiáng)，但在分子水平上的研究鮮有報(bào)道。
　　本研究目的在于結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)深入研究低溫脅迫前后不同

2、倍性西瓜的基因表達(dá)差異，以‘京欣1號(hào)’西瓜的母本‘83166’（二倍體）及其同源三倍體、四倍體為材料，應(yīng)用MSAP技術(shù)、cDNA-AFLP技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)低溫處理前后不同倍性西瓜基因表達(dá)差異進(jìn)行研究，研究結(jié)果如下:
　　1.MSAP技術(shù)對(duì)低溫處理前后不同倍性西瓜基因組DNA進(jìn)行分析。通過(guò)28對(duì)引物擴(kuò)增共得到3534條譜帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出126條譜帶。就CCGG位點(diǎn)發(fā)生甲基化而言，不同倍體西瓜及低溫處理后材料均以發(fā)

3、生雙鏈DNA內(nèi)部甲基化比例最高，說(shuō)明雙鏈DNA內(nèi)部甲基化是西瓜材料的主要形式。低溫處理前，不同倍性西瓜之間的全甲基化率、半甲基化率及總甲基化率差異均不顯著。低溫處理后，以半甲基化率差異最為明顯，其中二倍體、低溫處理后二倍體半甲基化率分別為12.8％、9.3％;三倍體、低溫處理后三倍體半甲基化率分別為15.3％、10.0％;四倍體、低溫處理后四倍體半甲基化率分別為14.8％、8.3％。用U檢測(cè)法分析，二倍體低溫處理前后半甲基化差異不顯著，

4、三倍體差異顯著，四倍體差異極顯著，與倍性呈正相關(guān)。對(duì)DNA甲基化模式的變化特征分析發(fā)現(xiàn)，不同倍性西瓜低溫處理前后的甲基化模式大部分未改變，但也有部分位點(diǎn)甲基化模式進(jìn)行了調(diào)整。低溫處理后二倍體、三倍體、四倍體發(fā)生去甲基化位點(diǎn)比例為18.4％、17.7％、17.8％，發(fā)生過(guò)甲基化比例為18.4％、17.0％、16.0％，說(shuō)明不同倍性西瓜間的表觀遺傳變異機(jī)理有很大差別。選取13條差異帶與西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)有7條是西瓜基因組序列，經(jīng)BLAST

5、X比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)這些基因與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境脅迫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。
　　2.利用cDNA-AFLP技術(shù)分析低溫處理前后不同倍性西瓜的基因差異表達(dá)。通過(guò)26對(duì)引物擴(kuò)增共得到1927條帶，其中二倍體、三倍體、四倍體的上調(diào)表達(dá)比例分別為48.2％、51.3％、58.6％，與倍性呈正相關(guān);二倍體、三倍體、四倍體的下調(diào)表達(dá)比例分別為51.8％、48.7％、41.4％，與倍性呈負(fù)相關(guān)。選取54條差異帶進(jìn)行回收測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)分析這些

6、差異表達(dá)基因片段按功能可以分為7類，包括假定蛋白(25.9％)，能量與代謝相關(guān)(31.5％)，物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)(5.6％)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)(3.7％)，DNA修飾相關(guān)(1.9％)，逆境相關(guān)(1.9％)及未知蛋白(29.6％)。
　　3.利用熒光定量PCR檢測(cè)上調(diào)表達(dá)基因在西瓜內(nèi)的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，低溫處理后乙酰輔酶A羧化酶的羧基轉(zhuǎn)移酶β亞基是對(duì)照材料中表達(dá)量的3.56倍、低溫處理后鋅指蛋白是對(duì)照材料中表達(dá)量的1.45倍、低溫處理后NADH脫氫