番石榴葉提取物抑制HIV包膜蛋白亞基gp41六股螺旋束形成的研究.pdf

1、艾滋?。╝cquired immunodeficiency syndrome，AIDS）又稱(chēng)獲得性免疫缺陷綜合征，是由人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的傳染性疾病。自從20世紀(jì)80年代首次報(bào)告艾滋病臨床病例以來(lái)，艾滋病在世界迅速蔓延，目前在全球已呈爆發(fā)性流行趨勢(shì)，對(duì)人口平均壽命和世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生了巨大的影響，成為21世紀(jì)人類(lèi)面臨的最重大公共健康問(wèn)題。艾滋病已經(jīng)成為人類(lèi)前所未有的最具

2、毀滅性的疾病。至今，發(fā)達(dá)國(guó)家已投入了大量的資金及人力資源，對(duì)HIV本身以及抗HIV的藥物進(jìn)行研究。目前被批準(zhǔn)用于臨床的治療AIDS的藥物主要分為核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（nucleocide reverse transcriptase inhibitors，NRTI）、非核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors，NNRTI）、蛋白酶抑制劑（Protease Inhi

3、bitor，PI）、整合酶抑制劑和進(jìn)入抑制劑5大類(lèi)，這些藥物主要是通過(guò)和底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶或結(jié)合到酶上使之變性，抑制酶的活性，從而破壞HIV的生活周期，達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的。這些藥物可以在一定程度上延緩病人病情的惡化，但并不能徹底清除患者體內(nèi)的病毒。大部分病人一直生活在病毒低水平復(fù)制的狀態(tài)中，長(zhǎng)期用藥患者將產(chǎn)生抗藥性，并且一旦停止用藥，病人體內(nèi)病毒水平很快又恢復(fù)到甚至超過(guò)用藥前的水平。 在HIV感染過(guò)程中，首先是HIV包被膜與靶細(xì)

4、胞的細(xì)胞膜發(fā)生融合。HIV與靶細(xì)胞融合主要由包膜糖蛋白gp160（由包膜表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41非共價(jià)結(jié)合而成）介導(dǎo)。Gp120與靶細(xì)胞上的CD4分子和輔助受體（趨化因子受體CCR5或CXCR4等）依次結(jié)合，導(dǎo)致gp41的構(gòu)型發(fā)生改變，形成6股α-螺旋束核心結(jié)構(gòu)，將病毒包膜與靶細(xì)胞膜拉近并發(fā)生融合，完成病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的感染過(guò)程。因此，抑制融合過(guò)程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)，就能抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞，從而預(yù)防和治療HIV的感染。G

5、p120、gp41、CD4、趨化因子受體（CXCR4或CCR5等）均可作為HIV進(jìn)入抑制劑的藥物作用靶點(diǎn)。 由于化學(xué)藥物在臨床治療中療效不甚理想，而且副作用較大，于是我國(guó)醫(yī)藥工作者從祖國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中尋求中醫(yī)中藥對(duì)艾滋病的治療，從而推動(dòng)世界各國(guó)從植物中篩查預(yù)防與治療艾滋病的藥物研究。在對(duì)中草藥有效成分的分析研究中發(fā)現(xiàn)，一些中草藥的多糖、皂苷、生物堿、黃酮以及蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)可以抑制HIV復(fù)制，具有很好的抗HIV病毒活性。黃酮類(lèi)（fla

6、vonoids）是一大類(lèi)天然存在的具有抗病毒活性的化合物，研究發(fā)現(xiàn)其顯示出對(duì)HIV良好的抑制活性。皂苷（saponin）是天然產(chǎn)物中一類(lèi)重要的化學(xué)成分。皂苷具有多種多樣且相當(dāng)重要的藥理活性和生物活性，如抗腫瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等，從而顯示出廣闊的應(yīng)用前景。揮發(fā)油也稱(chēng)精油（volatile oil），是存在于植物體中的一類(lèi)具有揮發(fā)性、可隨水蒸氣蒸餾出來(lái)的油狀液體的總稱(chēng)。揮發(fā)油在植物界分布極廣，作為中藥使用的植物就有

7、數(shù)百種含有揮發(fā)油，尤其在菊科、蕓香科、傘形科、姜科等科屬中較為常見(jiàn)。揮發(fā)油具有抗腫瘤、抗菌、抗過(guò)敏和抗病毒作用，并具有一定的酶抑制活性。本實(shí)驗(yàn)主要研究從番石榴葉中提取的三種成分皂苷、黃酮及揮發(fā)油抑制HIV包膜蛋白亞基gp41六股螺旋束形成的作用。 目的: 從番石榴葉中提取出皂苷、黃酮及揮發(fā)油，研究三種提取物對(duì)HIV包膜蛋白亞基gp41六股螺旋束的抑制作用，為尋求新的抗HIV病毒進(jìn)入抑制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:

8、 1.實(shí)驗(yàn)用HeLa細(xì)胞傳代按1×105個(gè)/ml的密度用10%完全培養(yǎng)基接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔種植100μl。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞隨機(jī)（隨機(jī)方法參照文獻(xiàn)[21]）分組：對(duì)照組（control）及其他不同劑量組（皂苷、黃酮分為1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml、0.03125 mg/ml；揮發(fā)油分為50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、1μg/ml

9、、0.0μg/ml），每組設(shè)4孔。用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制不同濃度藥物，每孔加入100μl，干預(yù)24h后，MTT法測(cè)OD值，求出其半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（median toxic concentration，TC50）。 2.予TC50以下的不同濃度的皂苷、黃酮及揮發(fā)油，用夾心酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)番石榴葉提取物對(duì)HIV包膜蛋白亞基gp41六股螺旋束結(jié)構(gòu)形成的抑制作用。N36和C34是從HIV gp41的NHR和C

10、RH區(qū)衍生出來(lái)的多肽，二者在體外能形成類(lèi)似gp41 NHR和CRH結(jié)合的螺旋結(jié)構(gòu)。因此，抗gp41六螺旋束核心結(jié)構(gòu)的活性可以用抑制N36和C34結(jié)合的作用來(lái)測(cè)定。 3.統(tǒng)計(jì)方法：運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。各組MTT比色法結(jié)果比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。組間均數(shù)兩兩比較，若方差齊性，用LSD（Least Significant Difference）法；

11、若方差不齊性，用Dunnett's T3方法。P<0.05表示有顯著差異。 結(jié)果: 1.MTT法測(cè)得各個(gè)不同樣品濃度作用后的細(xì)胞存活率，藥物的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（TC50）用PHARM/PCS-VERSION4軟件計(jì)算得出：番石榴葉的三種提取物皂苷、黃酮、揮發(fā)油的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（TC50）分別為137.6μg/ml，71.62μg/ml，23.63μg/ml。皂苷、黃酮在最大濃度（1mg/ml）時(shí)細(xì)胞存活率分別為17.2

12、8%、14.53%，在最低濃度（0.03125mg/ml）時(shí)細(xì)胞存活率分別為93.32%、85.64%。揮發(fā)油在最大濃度（50μg/ml）和最低濃度（0.1μg/ml）時(shí)細(xì)胞存活率分別為25.39%、82.21%。 2.應(yīng)用基于抗原抗體反應(yīng)的夾心ELISA法對(duì)皂苷、黃酮及揮發(fā)油三種化合物進(jìn)行了篩選，在終濃度為25μg/ml時(shí)皂苷與黃酮對(duì)HIV gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成有明顯抑制作用，二者的抑制率都大于50%，而揮發(fā)油在終濃度為2

13、5μg/ml時(shí)的抑制率較低，低于50%，而且皂苷和黃酮組的抑制率顯著高于揮發(fā)油組。揮發(fā)油組、皂苷組與黃酮組三組均數(shù)間都有顯著差異（P<0.0001）。組間兩兩比較顯示，揮發(fā)油組與皂苷組、黃酮組比較均有顯著差異（P<0.001），皂苷組與黃酮組相比無(wú)顯著性差異（P＝0.507）。故在初步篩選后棄掉揮發(fā)油，皂苷和黃酮進(jìn)一步做梯度稀釋計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。皂苷、黃酮稀釋為25μg/ml、15μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml、

14、0.25μg/ml五個(gè)濃度梯度，二者均在25μg/ml的時(shí)候抑制大部分gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)的形成，皂苷在2.5μg/ml時(shí)以及黃酮在1μg/ml時(shí)能夠抑制部分六螺旋束結(jié)構(gòu)的形成。二者相比較，黃酮的抑制作用比皂苷稍強(qiáng)。通過(guò)計(jì)算得皂苷和黃酮的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為5.65μg/ml、0.87μg/ml。這說(shuō)明了皂苷和黃酮類(lèi)化合物能夠作用于HIV gp41抑制其形成六螺旋束核心結(jié)構(gòu)，可能也在抑制HIV與靶細(xì)胞融合中發(fā)揮作用。