基于碳納米材料的致病菌快速檢測方法研究.pdf

1、近些年來，由于碳納米材料具有各種優(yōu)良的特點，例如:出色的生物相容性以及穩(wěn)定性，低合成成本與毒性等，被廣泛的應(yīng)用于各種生物領(lǐng)域。其主要形態(tài)包括碳納米管，石墨烯，納米碳顆粒等。按照熒光性區(qū)分又能分為有熒光性的納米碳顆粒一類與有猝滅特性的碳納米管石墨烯一類。本文以碳點為材料，合成出分子信標(biāo)。該信標(biāo)包含碳點(CNPs)、猝滅基團(tuán)(BHQ1)以及特異性核苷酸序列。利用該分子信標(biāo)，分別以腸炎沙門氏菌的16S rRNA以及甲型副傷寒沙門氏菌菌體為靶標(biāo)

2、，設(shè)計了兩種利用碳納米顆粒為熒光染料的檢測體系，分別對這兩種沙門氏菌進(jìn)行了快速檢測。主要包括以下兩方面工作:
　　1.檢測腸炎沙門氏菌的16S rRNA。核糖體是一類廣泛被用做檢測靶標(biāo)的物質(zhì)，它能夠和特異性的核苷酸探針進(jìn)行結(jié)合。比起傳統(tǒng)方法，利用核糖體作為靶標(biāo)設(shè)計探針要更加簡便與快捷。這一部分闡述了一種基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移，利用腸炎沙門氏菌16S rRNA的V3-V6區(qū)域特異序列為靶標(biāo)的檢測方法。在該體系中，單壁碳納米管(SWNT

3、s)對固定在上面的設(shè)計探針具有吸附性，兩者之間以π-π鍵相結(jié)合。當(dāng)反應(yīng)溶液中存在有靶標(biāo)的時候，由于探針與靶標(biāo)之間的穩(wěn)定性大于探針與碳納米管之間的穩(wěn)定性，因此探針被從碳納米管上拉離下來，并將分子信標(biāo)的結(jié)合位點暴露出來。隨后，分子信標(biāo)與探針結(jié)合，形成的雙鏈結(jié)構(gòu)被切刻酶特異性識別、切斷。切斷后的分子信標(biāo)由于太短以至不能夠再維持原有形態(tài)，最終從探針上脫落下來。此時能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象消失，碳點發(fā)出熒光。而加入其他細(xì)菌的16S rRNA時，熒光信號不

4、會被檢測到。結(jié)果證明，該方法對檢測16S rRNA的V3-V6區(qū)域特異序列有很高的靈敏性與特異性。其檢測下限在超純水中達(dá)到了100CFU/ml，在牛奶樣品中達(dá)到了150CFU/ml。在102～3×103CFU/mL（水中）以及1.5×102～3×103CFU/mL（牛奶）的濃度范圍內(nèi)存在線性關(guān)系。實驗結(jié)果顯示這種基于FRET的檢測方法能夠被用來檢測致病菌，并加以廣泛應(yīng)用。
　　2.利用適配體設(shè)計探針檢測甲型副傷寒沙門氏菌。該方法利

5、用熒光能量共振轉(zhuǎn)移和核酸外切酶的識別特異性對甲型副傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測。在該檢測體系中，分子信標(biāo)上的碳點由于熒光能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，在490nm的激發(fā)波長下并不發(fā)出熒光。DNA探針包含三個部分:5'端的多余部分，中間的適配體部分，3'端的多余部分。當(dāng)反應(yīng)溶液中加入甲型副傷寒沙門氏菌后，DNA探針上的適配體部分能夠與細(xì)菌結(jié)合，而兩端余留的核苷酸片段則不會，最終探針和細(xì)菌形成了一個Ω型結(jié)構(gòu)。此時分子信標(biāo)同探針兩端多余的部分互補(bǔ)配對，形成雙鏈結(jié)