表達密碼子優(yōu)化犬細小病同毒VP2蛋白重組犬瘟熱弱毒疫苗株的構建.pdf

1、犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的傳染犬科動物的，高度接觸性、致死性疾病，以出血性腸炎和亞急性心肌炎為特征。犬細小病毒病主要通過糞-口途徑傳播，幼犬最易感染。目前，犬細小病毒病已經(jīng)在我國廣泛流行，嚴重威脅著我國的養(yǎng)犬業(yè)和皮毛動物養(yǎng)殖業(yè)。疫苗接種是防控犬細小病毒病的最有效方法。犬細小病毒病滅活疫苗只能誘導一個短期的免疫反應;由于新的抗原變異毒株的出現(xiàn)，弱毒疫苗接種有時會出現(xiàn)免疫失敗。
　　

2、隨著反向遺傳技術的發(fā)展和成熟，單股負鏈RNA病毒成為了疫苗載體的研究熱點。犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引發(fā)的感染多種動物的急性致死性傳染病，給我國的犬養(yǎng)殖業(yè)和毛皮動物業(yè)造成了嚴重的損失。目前，全世界應用最為廣泛的犬瘟熱疫苗是弱毒疫苗。利用犬瘟熱弱毒疫苗為載體，研制犬細小病毒病、犬瘟熱二聯(lián)活載體疫苗，可實現(xiàn)一苗兩防，降低疫苗生產(chǎn)成本，也可針對新出現(xiàn)的

3、抗原變異亞型毒株快速地進行疫苗更新。
　　按照哺乳動物的密碼子偏好性對外源抗原蛋白基因進行密碼子優(yōu)化，能夠提高該蛋白在哺乳動物體內(nèi)或細胞內(nèi)的表達量，為提高疫苗的免疫效力提供了新的方法。本研究，利用本實驗已建立的CD弱毒疫苗株CDV/R-20/8的反向遺傳技術平臺，構建了表達密碼子優(yōu)化CPVVP2蛋白的重組犬瘟熱病毒r20/8-CPVVP2opti。免疫熒光實驗和Western blot實驗表明，重組病毒r20/8-CPVVP2op

4、ti感染的BHK-21細胞中，CPVVP2蛋白得到了正確表達。重組病毒r20/8-CPVVP2opti保持了親本毒株r20/8在Vero細胞上的生長特性，經(jīng)實驗測定具有生長滴度高的特點，其最高生長滴度可達到106.75 TCID50/ml。Western blot證實，密碼子優(yōu)化可顯著提高CPVVP2蛋白在重組犬瘟熱病毒r20/8-CPVVP2opti感染細胞中的表達量。以表達密碼子優(yōu)化CPVVP2蛋白重組犬瘟熱病毒r20/8-CPVV

5、P2opti表達野生型CPVVP2蛋白重組犬瘟熱病毒r20/8-CPVVP2和親本毒株r20/8分別按104.5 TCID50/100μl/只的劑量以肌肉注射的方式，兩次免疫接種小鼠。r20/8-CPVVP2opti、r20/8-CPVVP2和r20/8免疫小鼠，均誘導低水平的CDV中和抗體反應，且3組免疫小鼠血清中CDV中和抗體滴度無顯著性差異;然而，r20/8-CPVVP2opti、r20/8-CPVVP2免疫小鼠，均可誘導顯著的C

6、PV血凝抑制(HI)抗體反應，加強免疫后1周，CPVHI抗體反應顯著增強，且r20/8-CPVVP2opti免疫小鼠血清中CPV HI抗體滴度顯著地高于r20/8-CPVVP2免疫小鼠免疫小鼠血清中CPV HI抗體滴度。結果表明，利用密碼子優(yōu)化CPVVP2蛋白基因構建CPV、CDV活載體疫苗，能增強在免疫動物體內(nèi)誘導的CPV HI抗體反應，有助于提高該疫苗抗CPV感染的免疫效力。
　　本研究結果表明，表達密碼子優(yōu)化CPVVP2蛋白