NAD對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的影響.pdf

1、背景:在高血壓和心肌缺血等疾病中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活是其重要特征，RAS激活后合成和釋放AngⅡ能夠誘發(fā)一系列生理病理過程，病理過程積累最終可以導(dǎo)致心衰。在心臟中AngⅡ可以通過提高NAD(P)H氧化酶的產(chǎn)生而增加ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)心肌肥厚和調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞的增殖及膠原代謝，導(dǎo)致心臟重構(gòu)。心肌纖維化是心臟重構(gòu)的主要病理變化之一，主要表現(xiàn)為大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在細(xì)胞外間隙沉積和心肌成纖維細(xì)胞的過度增殖。
　　 煙酰

2、胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是生物催化反應(yīng)必不可少的輔酶，它在很多轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。NAD依賴的去乙?；窼irt1在NAD的參與下能夠調(diào)節(jié)組蛋白的乙酰化狀態(tài)，在增強(qiáng)心臟對(duì)氧化應(yīng)激的耐受，調(diào)節(jié)能量代謝及抗老化等方面起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)就是考慮通過NAD增加細(xì)胞內(nèi)NAD/NADH的比值，提高Sirt1等脫乙酰化酶的表達(dá)而促進(jìn)抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶等的活性，降低AngⅡ引起的細(xì)胞內(nèi)升高的ROS水平，從而

3、抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成與沉積，起到抑制心肌纖維化病理過程的作用。
　　 目的:(1)探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原纖維mRNA表達(dá)的作用及可能機(jī)制。
　　 (2)探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法:提取并培養(yǎng)新生Wistar大鼠原代心肌成纖維細(xì)胞(CFs)，實(shí)驗(yàn)采用2-

4、4代，以AngⅡ(0.01μmol/L，0.1μmol/L，1μmol/L)刺激24小時(shí)，提取總RNA檢測(cè)不同濃度AngⅡ?qū)Fs的作用，選擇合適濃度AngⅡ的進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。在六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，生長(zhǎng)到合適密度后饑餓細(xì)胞24小時(shí)，采用250μmol/LNAD預(yù)處理后，用終濃度1μmol/LAngⅡ作用于心肌成纖維細(xì)胞24小時(shí)，提取總RNA。用Sirt1-siRNA預(yù)處理細(xì)胞將Sirt1基因沉默后，再用250μmol/LNAD和終濃度1μ

5、mol/LAngⅡ作用于心肌成纖維細(xì)胞24小時(shí)，提取總RNA。RealtimeRT-PCR法分別檢測(cè)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-1、Sirt1、TGF-β1、NF-κB等各個(gè)指標(biāo)的mRNA表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，250μmol/LNAD和終濃度1μmol/LAngⅡ作用于心肌成纖維細(xì)胞48小時(shí)后，用Edu法檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞增殖變化。
　　 結(jié)果:(1)CFs細(xì)胞Ⅰ型膠原的mRNA隨AngⅡ濃度增加而表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，表

6、現(xiàn)為對(duì)AngⅡ的濃度依賴性;
　　 (2)NAD預(yù)處理后，AngⅡ刺激Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)與AngⅡ組相比較明顯減少(P＜0.05);與對(duì)照組比較，NAD作用組collagenⅠ和collagenⅢmRNA表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Sirt1-siRNA轉(zhuǎn)染預(yù)處理24小時(shí)后，與FAM組比較，Sirt1-siRNA組Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，與FAM+AngⅡ組比較，Sirt1-

7、siRNA+AngⅡ組Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)明顯增加(P＜0.01);與Sirt1-siRNA+AngⅡ組比較，Sirt1-siRNA+AngⅡ+NAD組Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)減少(P＜0.05);
　　 (3)AngⅡ作用后，與對(duì)照組比較MMP-1mRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，NAD組MMP-1mRNA表達(dá)也明顯減少(P＜0.05)，而NAD+AngⅡ作用組MMP-1mRNA的表達(dá)與AngⅡ組比較表達(dá)無明顯變化(P＞0

8、.05);
　　 (4)NAD作用后與對(duì)照組比較，Sirt1mRNA表達(dá)增加(P＜0.05);Sirt1-siRNA轉(zhuǎn)染預(yù)處理24小時(shí)后，各組Sirt1mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯減少(P＜0.05);
　　 (5)與對(duì)照組比較，NAD組NF-κBmRNA的表達(dá)無明顯變化(P＞0.05);AngⅡ組NF-κBmRNA的表達(dá)明顯增高(P＜0.01);NAD+AngⅡ組NF-κB的mRNA表達(dá)量與AngⅡ組相比較明顯減少(P＜0

9、.05);Sirt1-siRNA轉(zhuǎn)染預(yù)處理24小時(shí)后，與FAM組比較，轉(zhuǎn)染后各組NF-κBmRNA的表達(dá)明顯增高(P＜0.05);而Sirt1-siRNA+AngⅡ組與Sirt1-siRNA+AngⅡ+NAD組比較，NF-κBmRNA的表達(dá)較表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 (6)與對(duì)照組增殖率（單位100％）30.8±1.7比較，AngⅡ處理細(xì)胞后心肌成纖維細(xì)胞的增殖率42.7±1.1，NAD+AngⅡ

10、共同處理細(xì)胞后，相對(duì)于AngⅡ組，心肌成纖維細(xì)胞的增殖減少，增殖率35.1±1.4(P＜0.05)。Sirt1-siRNA轉(zhuǎn)染預(yù)處理24小時(shí)后，各組變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)染前無明顯變化，增殖率分別為對(duì)照組35.9±2.1,Sirt1-siRNA+AngⅡ組47.1±1.9,Sirt1-siRNA+AngⅡ+NAD組38.9±2.4;
　　 (7)NAD處理細(xì)胞后與對(duì)照組比較，TGF-β1mRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，AngⅡ組TG

11、F-β1mRNA的表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，NAD+AngⅡ組與AngⅡ組比較TGF-β1mRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.01);Sirt1-siRNA轉(zhuǎn)染預(yù)處理24小時(shí)后，Sirt1-siRNA+AngⅡ+NAD組與Sirt1-siRNA+AngⅡ組相比較，TGF-β1mRNA的表達(dá)減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:(1)NAD可在一定程度上通過Sirt1抑制AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，能夠