Bacillus cereus B-02拮抗作用相關(guān)基因的克隆與檢測(cè).pdf

1、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)B-02分離自淄博市感染灰霉病的大棚蔬菜土壤，是一株具有很強(qiáng)的抗灰霉病菌(Botrytis cinerea)活性的拮抗細(xì)菌。為探討菌株對(duì)Bo.cinerea的防病機(jī)理，利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法構(gòu)建B-02抑菌活性消失的突變體，并通過(guò)TAIL-PCR方法研究轉(zhuǎn)座因子的插入位點(diǎn)及其側(cè)翼基因，旨在克隆發(fā)現(xiàn)新的抑菌功能相關(guān)基因，進(jìn)而分析該位點(diǎn)所在基因或其側(cè)翼基因?qū)υ摫硇偷恼{(diào)控機(jī)制?！　√崛】莶菅挎邨U菌(Ba

2、cillussubtilis)PY143中攜帶轉(zhuǎn)座子Tn917的非穿梭性溫度敏感型質(zhì)粒pTV1，電擊轉(zhuǎn)化pTV1質(zhì)粒至野生Ba. cereus B-02菌株，在電壓9.0-12.5kv/cm，電阻200Ω，電容25μF的電擊轉(zhuǎn)化條件下，得到了具有氯霉素抗性且可以穩(wěn)定、持續(xù)復(fù)制的轉(zhuǎn)化子17個(gè)，并經(jīng)質(zhì)粒電泳及PCR檢測(cè)證實(shí)。將得到的轉(zhuǎn)化子在44.5℃持續(xù)地高溫誘變，pTV1質(zhì)粒消除，Tn917插入到Ba.cereus B-02基因組中，篩選

3、得到具有紅霉素和林可霉素抗性但失去氯霉素抗性的轉(zhuǎn)座突變子1670個(gè)，在本實(shí)驗(yàn)中平均轉(zhuǎn)座效率為4.29×10<'-4>，通過(guò)繼代培養(yǎng)，證明突變菌株具有遺傳穩(wěn)定性，表明Tn917插入片段在大多數(shù)突變菌株中可以穩(wěn)定遺傳，經(jīng)PCR檢測(cè)，可證明pTV1中的Tn917片段插入到Ba.cereus B-02基因組中。進(jìn)一步測(cè)定這些突變子對(duì)Bo.cinerea的抑制作用，最終篩選得到了1個(gè)對(duì)病原菌抑制能力喪失的突變子，命名為B-02-T。隨機(jī)選擇6株突

4、變菌株，以含部分Tn917片段的DIG標(biāo)記探針和EcoR I消化其基因組進(jìn)行southern雜交，結(jié)果證實(shí)突變菌株基因組中有且只有單一的Tn917插入，且可以隨機(jī)誘變Ba.cereus野生株，產(chǎn)生在不同位點(diǎn)突變的突變株。 采用TAIL-PCR法從突變菌株B-02-T中克隆Tn917插入位點(diǎn)側(cè)翼的序列，分別得到Tn917插入位點(diǎn)上下游兩條基因片段，經(jīng)去除載體污染、上下游基因拼接后，得到一段2705bp的基因序列，將其進(jìn)行blast