PKH26標(biāo)記單核細(xì)胞衍生的肝樣細(xì)胞裸鼠體內(nèi)示蹤的實驗研究.pdf

1、第一部分體外細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的實驗研究
　　 目的：
　　 探討肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和成纖維細(xì)胞生長因子-4(fibroblast growth factor-4，F(xiàn)GF-4)體外聯(lián)合誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的能力及分化后的細(xì)胞是否具有肝樣細(xì)胞的典型形態(tài)和生化特征。
　　 方法：
　　 密度梯度離心法和細(xì)胞貼壁篩

2、選法從外周血中分離并初步純化所獲取的單核細(xì)胞用于培養(yǎng)，誘導(dǎo)。實驗分別設(shè)立A，B兩組。A組為陰性對照組，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中不添加細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子HGF和FGF-4；B組應(yīng)用HGF和FGF-4體外聯(lián)合誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化。在不同分化階段觀察細(xì)胞形態(tài)特征的變化及采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測細(xì)胞甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)和細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)表達(dá)的情況
　　 結(jié)

3、果：
　　 A組細(xì)胞隨培養(yǎng)時間延長由剛分離出的單核細(xì)胞呈較均一的圓形逐漸變得不規(guī)則，呈條索狀，纖維樣改變，少部分細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞發(fā)生凋亡，裂解；B組細(xì)胞隨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞變大，變圓，呈集落生長，增殖活性強。于誘導(dǎo)2周后具有典型肝樣細(xì)胞形態(tài)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測A組細(xì)胞AFP和CK19表達(dá)呈陰性，而B組有AFP和CK19陽性表達(dá)，于誘導(dǎo)2周后AFP和CK19陽性表達(dá)最為明顯
　　 結(jié)論：
　　 在H

4、GF和FGF-4體外聯(lián)合誘導(dǎo)條件下，人外周血單核細(xì)胞具有向肝樣細(xì)胞分化的潛能及分化后的細(xì)胞具有肝樣細(xì)胞的典型形態(tài)和生化特征。
　　 第二部分 PKH26標(biāo)記單核細(xì)胞分化的肝樣細(xì)胞裸鼠體內(nèi)示蹤的實驗研究
　　 目的：
　　 探討PKH26標(biāo)記單核細(xì)胞衍生的肝樣細(xì)胞移植受體鼠肝組織過程中的有效示蹤劑，并進(jìn)一步觀察移植后的肝樣細(xì)胞存活，分布與轉(zhuǎn)歸情況。
　　 方法：
　　 以紅色熒光染料PKH26標(biāo)記單

5、核細(xì)胞衍生的肝樣細(xì)胞，尾靜脈注入受體鼠體內(nèi)作為實驗組。對照組注射等量生理鹽水，分別于移植2周后取肝組織，通過熒光顯微鏡觀察實驗組肝樣細(xì)胞向肝臟遷移與轉(zhuǎn)歸的情況。采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測移植的肝樣細(xì)胞白蛋白(albumin，ALB)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 動物實驗組受體鼠肝組織冰凍切片中可見大量PKH26標(biāo)記陽性的肝樣細(xì)胞，這些細(xì)胞主要分布在肝索區(qū)，并在肝索區(qū)的肝細(xì)胞間發(fā)生整合，于移植2周后行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染