鹽脅迫下兩個甜瓜品種的轉錄組分析.pdf

1、甜瓜是世界重要的果品之一,也是我國重要的設施栽培作物。甜瓜的耐鹽性在所有瓜類作物中僅次于南瓜,這使其有可能成為耐鹽高產的作物種質資源。甜瓜耐鹽性方面的研究主要集中在生理生化方面,有關甜瓜耐鹽的分子機制鮮有報道。隨著甜瓜基因組測序的完成和分子生物學技術的不斷發(fā)展,使得利用現代生物學手段來深入研究探討甜瓜的耐鹽分子機制成為可能,也有利于更全面地了解甜瓜的各種抗逆調控機制。
　　本研究首次利用高通量測序技術(Illumina)對兩個甜瓜

2、品種的正常葉片(對照)和300 mmol/L NaCl處理后的葉片進行轉錄組測序;對鹽脅迫前后兩個品種的離子流、葉綠素熒光、光合強度、蒸騰速率、氣孔導度、植株干鮮重等進行測量;結合轉錄組數據和生理數據全面分析甜瓜鹽脅迫下的基因表達變化,挖掘鹽脅迫響應基因,并對這些基因進行功能預測和代謝途徑分析;采用qPCR對轉錄組測序結果進行驗證,并進一步分析了12個編碼不同功能蛋白的基因在鹽脅迫1h,24 h,1周三個時間點的表達模式。
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3、要研究結論如下:
　　1、研究鹽脅迫對不同甜瓜品種幼苗葉綠素熒光參數、光合特征值、離子流、生物量的影響,為篩選耐鹽響應基因提供生理數據。高濃度 NaCl(300 mmol/L)脅迫使凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、Fv/Fm、ФPSII降低,初始熒光(F0)、胞間 CO2濃度(Ci)提高?！衤丁茺}脅迫的影響程度小于‘冰雪脆’。300 mmo l/L濃度的高鹽脅迫引起光合速率下降的主要原因是非氣孔限制。高

4、濃度 NaCl(300 mmol/L)脅迫使Na+、K+由內流狀態(tài)變?yōu)橥饬鳡顟B(tài),同時Cl-的內流量顯著增大,體現了甜瓜的自我防御機制。
　　2、Illumina測序平臺對兩個甜瓜品種的葉片組織的對照和300 mmol/L NaCl處理四份材料進行轉錄組測序。共得到近4千萬條100bp的高質量配對短序列,總數據量為7.67G。采用序列組裝軟件Cufflinks進行序列組裝,共獲得32625條基因。通過與已知甜瓜基因組數據進行序列比對

5、,匹配度可達85.77％?！┐唷汀衤丁瘶颖局械幕蚍謩e為17607條和22126條,分別占32625個總基因的54.5%和67.8%。
　　3、使用RP K M標準化處理方法,分別對兩個甜瓜品種鹽脅迫前后的測序文庫進行差異比較分析,‘冰雪脆’和‘玉露’分別有1171個和1487個基因存在顯著差異(︱log2Ratio︱≥1且P≤0.05)。‘冰雪脆’和‘玉露’有大量的共表達基因,包括232個共同上調基因和379個共同下調基

6、因,同時‘冰雪脆’和‘玉露’有1436個基因具有品種特異性。
　　4、將獲得的基因與NCBI數據庫NR進行比對(E-value<1e-6),對其功能進行注釋,根據NR數據庫注釋的信息,共有16875(占57.1%)條基因映射到GO不同的節(jié)點(term),并按照分子功能(Molecular function)、細胞組分(Cellular component)及參與的生物過程(Biological process)對這些基因進行分類。

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　　5、根據Blast2GO的結果統(tǒng)計,在‘冰雪脆’和‘玉露’共同上調的232個基因中,有155個(66.8%)在NCBI的N R數據庫中映射到GO不同的節(jié)點(term);共同下調的306個基因中,有127個(41.5%)基因映射到GO不同的節(jié)點(term)。在1436個‘冰雪脆’和‘玉露’特異性差異基因中,有894個(62.3%)基因映射到GO不同的節(jié)點(term)。即一共有1176個差異表達基因有GO注釋。對被注釋的1176

8、個差異表達基因進行了3個類別的分類,在生物過程中,細胞代謝、基礎代謝、大分子代謝、氮合成代謝、氧化還原過程、色素沉淀及生物功能的定位等注釋的基因富集,說明在甜瓜鹽脅迫過程中存在大量參與調控細胞代謝和氧化還原等生理生化過程的基因;而分子功能中,binding(離子結合等各種連接形式)和activity(包括催化酶、跨膜轉運蛋白、電子載體等)中注釋的基因最多。表明這些基因在甜瓜鹽脅迫后的生長發(fā)育、生理調控等方面發(fā)揮著重要作用。
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9、、通過對差異基因進行KEGG代謝通路富集分析,共有2166個差異表達基因注釋到26個代謝通路(Pathway),包括苯丙氨酸代謝途徑、植物激素信號轉導通路、次生代謝產物的生物合成、光合作用、淀粉和蔗糖代謝、二羧酸代謝等,表明鹽脅迫響應基因參與上述代謝途徑的調控,在甜瓜鹽脅迫調控等方面發(fā)揮著重要作用。并發(fā)現10個基因參與了2條苯丙氨酸次生代謝途徑。這些基因的發(fā)現豐富了鹽脅迫下次生代謝產物的調控數據。玉露的差異表達基因在生長素、細胞分裂素、

10、脫落酸、油菜素內酯等激素信號轉導通路中富集,這些基因的發(fā)現為研究鹽脅迫下甜瓜的激素信號轉導途徑及調控機制提供參考數據。
　　7、采用qPCR法對12個差異表達基因(包括轉錄因子、硝酸鹽轉運體、水通道蛋白和鉀離子通道基因)進行基因表達水平的驗證,結果表明 qPCR法與轉錄組分析結果基本一致,說明分析結果基本反映了甜瓜葉片組織內基因的真實表達情況。
　　8、鹽脅迫下兩種甜瓜品種表現的不同葉綠素熒光參數體現了這兩個品種鹽脅迫時轉錄

11、水平調控方式可能有所差異。通過鑒定兩個品種鹽脅迫應答轉錄因子,比較轉錄因子的表達差異,加深對甜瓜轉錄因子表達特性的了解,為進一步深入研究這些轉錄因子的功能提供參考。
　　9、在‘玉露’和‘冰雪脆’的鹽脅迫差異表達基因中篩選得到甜瓜轉錄組中與鹽脅迫過程密切相關的參與物質運輸與調控、抗氧化調節(jié)、糖代謝途徑、細胞壁組成、光合作用的相關基因及熱激蛋白、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白等與鹽脅迫相關的基因,它們涉及了植物的物質運輸、信號傳遞、活性氧清除