鹽脅迫下兩個甜瓜品種的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、甜瓜是世界重要的果品之一,也是我國重要的設(shè)施栽培作物。甜瓜的耐鹽性在所有瓜類作物中僅次于南瓜,這使其有可能成為耐鹽高產(chǎn)的作物種質(zhì)資源。甜瓜耐鹽性方面的研究主要集中在生理生化方面,有關(guān)甜瓜耐鹽的分子機制鮮有報道。隨著甜瓜基因組測序的完成和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,使得利用現(xiàn)代生物學(xué)手段來深入研究探討甜瓜的耐鹽分子機制成為可能,也有利于更全面地了解甜瓜的各種抗逆調(diào)控機制。
　　本研究首次利用高通量測序技術(shù)(Illumina)對兩個甜瓜

2、品種的正常葉片(對照)和300 mmol/L NaCl處理后的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序;對鹽脅迫前后兩個品種的離子流、葉綠素?zé)晒?、光合強度、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、植株干鮮重等進(jìn)行測量;結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和生理數(shù)據(jù)全面分析甜瓜鹽脅迫下的基因表達(dá)變化,挖掘鹽脅迫響應(yīng)基因,并對這些基因進(jìn)行功能預(yù)測和代謝途徑分析;采用qPCR對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行驗證,并進(jìn)一步分析了12個編碼不同功能蛋白的基因在鹽脅迫1h,24 h,1周三個時間點的表達(dá)模式。
　　主

3、要研究結(jié)論如下:
　　1、研究鹽脅迫對不同甜瓜品種幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)、光合特征值、離子流、生物量的影響,為篩選耐鹽響應(yīng)基因提供生理數(shù)據(jù)。高濃度 NaCl(300 mmol/L)脅迫使凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、Fv/Fm、ФPSII降低,初始熒光(F0)、胞間 CO2濃度(Ci)提高?！衤丁茺}脅迫的影響程度小于‘冰雪脆’。300 mmo l/L濃度的高鹽脅迫引起光合速率下降的主要原因是非氣孔限制。高

4、濃度 NaCl(300 mmol/L)脅迫使Na+、K+由內(nèi)流狀態(tài)變?yōu)橥饬鳡顟B(tài),同時Cl-的內(nèi)流量顯著增大,體現(xiàn)了甜瓜的自我防御機制。
　　2、Illumina測序平臺對兩個甜瓜品種的葉片組織的對照和300 mmol/L NaCl處理四份材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。共得到近4千萬條100bp的高質(zhì)量配對短序列,總數(shù)據(jù)量為7.67G。采用序列組裝軟件Cufflinks進(jìn)行序列組裝,共獲得32625條基因。通過與已知甜瓜基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對

5、,匹配度可達(dá)85.77％。‘冰雪脆’和‘玉露’樣本中的基因分別為17607條和22126條,分別占32625個總基因的54.5%和67.8%。
　　3、使用RP K M標(biāo)準(zhǔn)化處理方法,分別對兩個甜瓜品種鹽脅迫前后的測序文庫進(jìn)行差異比較分析,‘冰雪脆’和‘玉露’分別有1171個和1487個基因存在顯著差異(︱log2Ratio︱≥1且P≤0.05)?！┐唷汀衤丁写罅康墓脖磉_(dá)基因,包括232個共同上調(diào)基因和379個共同下調(diào)基

6、因,同時‘冰雪脆’和‘玉露’有1436個基因具有品種特異性。
　　4、將獲得的基因與NCBI數(shù)據(jù)庫NR進(jìn)行比對(E-value<1e-6),對其功能進(jìn)行注釋,根據(jù)NR數(shù)據(jù)庫注釋的信息,共有16875(占57.1%)條基因映射到GO不同的節(jié)點(term),并按照分子功能(Molecular function)、細(xì)胞組分(Cellular component)及參與的生物過程(Biological process)對這些基因進(jìn)行分類。

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　　5、根據(jù)Blast2GO的結(jié)果統(tǒng)計,在‘冰雪脆’和‘玉露’共同上調(diào)的232個基因中,有155個(66.8%)在NCBI的N R數(shù)據(jù)庫中映射到GO不同的節(jié)點(term);共同下調(diào)的306個基因中,有127個(41.5%)基因映射到GO不同的節(jié)點(term)。在1436個‘冰雪脆’和‘玉露’特異性差異基因中,有894個(62.3%)基因映射到GO不同的節(jié)點(term)。即一共有1176個差異表達(dá)基因有GO注釋。對被注釋的1176

8、個差異表達(dá)基因進(jìn)行了3個類別的分類,在生物過程中,細(xì)胞代謝、基礎(chǔ)代謝、大分子代謝、氮合成代謝、氧化還原過程、色素沉淀及生物功能的定位等注釋的基因富集,說明在甜瓜鹽脅迫過程中存在大量參與調(diào)控細(xì)胞代謝和氧化還原等生理生化過程的基因;而分子功能中,binding(離子結(jié)合等各種連接形式)和activity(包括催化酶、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白、電子載體等)中注釋的基因最多。表明這些基因在甜瓜鹽脅迫后的生長發(fā)育、生理調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。
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9、、通過對差異基因進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析,共有2166個差異表達(dá)基因注釋到26個代謝通路(Pathway),包括苯丙氨酸代謝途徑、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、光合作用、淀粉和蔗糖代謝、二羧酸代謝等,表明鹽脅迫響應(yīng)基因參與上述代謝途徑的調(diào)控,在甜瓜鹽脅迫調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。并發(fā)現(xiàn)10個基因參與了2條苯丙氨酸次生代謝途徑。這些基因的發(fā)現(xiàn)豐富了鹽脅迫下次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控數(shù)據(jù)。玉露的差異表達(dá)基因在生長素、細(xì)胞分裂素、

10、脫落酸、油菜素內(nèi)酯等激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中富集,這些基因的發(fā)現(xiàn)為研究鹽脅迫下甜瓜的激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及調(diào)控機制提供參考數(shù)據(jù)。
　　7、采用qPCR法對12個差異表達(dá)基因(包括轉(zhuǎn)錄因子、硝酸鹽轉(zhuǎn)運體、水通道蛋白和鉀離子通道基因)進(jìn)行基因表達(dá)水平的驗證,結(jié)果表明 qPCR法與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致,說明分析結(jié)果基本反映了甜瓜葉片組織內(nèi)基因的真實表達(dá)情況。
　　8、鹽脅迫下兩種甜瓜品種表現(xiàn)的不同葉綠素?zé)晒鈪?shù)體現(xiàn)了這兩個品種鹽脅迫時轉(zhuǎn)錄

11、水平調(diào)控方式可能有所差異。通過鑒定兩個品種鹽脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子,比較轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)差異,加深對甜瓜轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特性的了解,為進(jìn)一步深入研究這些轉(zhuǎn)錄因子的功能提供參考。
　　9、在‘玉露’和‘冰雪脆’的鹽脅迫差異表達(dá)基因中篩選得到甜瓜轉(zhuǎn)錄組中與鹽脅迫過程密切相關(guān)的參與物質(zhì)運輸與調(diào)控、抗氧化調(diào)節(jié)、糖代謝途徑、細(xì)胞壁組成、光合作用的相關(guān)基因及熱激蛋白、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白等與鹽脅迫相關(guān)的基因,它們涉及了植物的物質(zhì)運輸、信號傳遞、活性氧清除