凋亡抑制蛋白c-FLIP促進(jìn)肝癌細(xì)胞葡萄糖代謝機(jī)制的研究.pdf

1、肝癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，肝癌引起的死亡人數(shù)占到了世界癌癥死亡人口的三分之一，是我國第二大癌癥死亡原因。目前，我國肝癌發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升趨勢，帶來沉重的社會、醫(yī)療和家庭負(fù)擔(dān)。肝癌目前主要的治療方式有手術(shù)切除，肝移植，介入治療，以及放化療。由于近年分子靶向藥物在肝癌中的應(yīng)用，肝癌患者的預(yù)后有了一定程度的改善，但仍需要尋找更有效的肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)分子。由于肝癌惡性程度高，進(jìn)展迅速，往往發(fā)現(xiàn)較晚，造成腫瘤死亡率很高，在肝癌中

2、通過對肝癌發(fā)生發(fā)展過程中分子調(diào)控機(jī)制的研究，找到特異性的肝癌治療位點(diǎn)，并針對該治療位點(diǎn)開發(fā)肝癌藥物，在肝癌治療中具有重要的意義。
　　凋亡抑制蛋白c-FLIP（cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β-converting enzyme inhibitory protein）是1997報(bào)道發(fā)現(xiàn)的IAP家族中的一個重要成員，是一類含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的凋亡抑制蛋白

3、，在病毒、真核生物、哺乳動物等許多物種中廣泛存在，與炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，c-FLIP在細(xì)胞外凋亡通路，NF-κB通路，以及自噬和壞死通路中發(fā)揮重要的功能，有證據(jù)顯示，c-FLIP對很多蛋白泛素化過程具有調(diào)節(jié)作用。c-FLIP是在肝癌細(xì)胞中促進(jìn)腫瘤的增殖，在肝癌組織的中的表達(dá)較癌旁組織中高，與肝癌的預(yù)后具有負(fù)相關(guān)性。腫瘤的惡性增殖離不開能量物質(zhì)的供給和代謝失常，c-FLIP與肝癌細(xì)胞能量代謝是否相

4、關(guān)，目前還未見報(bào)道。
　　葡萄糖作為細(xì)胞的主要能源物質(zhì)，在腫瘤增殖過程中發(fā)揮重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝與正常組織的葡萄糖代謝是不同的。在腫瘤細(xì)胞中，葡萄糖主要通過有氧酵解的方式進(jìn)行代謝，產(chǎn)生大量的乳酸。在腫瘤細(xì)胞中，葡萄糖的攝取明顯高于正常組織，腫瘤細(xì)胞通過過表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體來滿足自身的葡萄糖需求。在不同的腫瘤細(xì)胞，表達(dá)不同的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。腫瘤葡萄糖代謝的改變主要依賴于細(xì)胞中各種癌基因和抑癌基因的共同作用來實(shí)現(xiàn)的。

5、
　　c-FLIP在肝癌中作為一種促進(jìn)腫瘤增殖的分子，是否對腫瘤的葡萄糖代謝具有影響呢？影響機(jī)制是什么？本課題針對上述問題進(jìn)行了深入的探討和研究。
　　目的:
　　明確c-FLIP對肝癌細(xì)胞葡萄糖代謝是否具有影響；闡明c-FLIP調(diào)控細(xì)胞葡萄糖代謝的機(jī)制；分析c-FLIP調(diào)控肝癌細(xì)胞葡萄糖代謝在肝癌發(fā)生發(fā)展中意義，以及與肝癌的臨床預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.將c-FLIPL干涉慢病毒感染細(xì)胞，構(gòu)建c

6、-FLIPL特異性干涉的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞；用能量實(shí)時檢測儀seahorse XF24 Analyer分析c-FLIPL對肝癌細(xì)胞葡萄糖代謝的影響；在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用熒光標(biāo)記的葡萄糖類似物2-NBDG，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞葡萄糖攝取能力，構(gòu)建小鼠肝癌荷瘤模型，并利用小動物PET-CT分析機(jī)體腫瘤葡萄糖攝取能力，同時在肝癌荷瘤模型中分析c-FLIPL對肝癌增殖的影響。
　　2.通過Western Blot和RT-PCR在蛋白和RNA水平分析c-

7、FLIPL對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響；通過蛋白質(zhì)泛素化檢測方法檢測c-FLIPL對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體泛素化降解影響；使用免疫共沉淀和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測蛋白質(zhì)間的相互作用。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞在低糖條件下細(xì)胞的凋亡水平；篩選出對低糖敏感的肝癌細(xì)胞系；分析c-FLIPL對低糖耐受的影響。
　　4.利用免疫組化技術(shù)測定肝癌及癌旁組織中c-FLIPL及其調(diào)控的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)；分析在肝癌中和癌旁組織中的表達(dá)是否具有差異，二者之間

8、的表達(dá)是否具有相關(guān)性；統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)與肝癌臨床分期的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.c-FLIPL促進(jìn)肝癌細(xì)胞糖酵解，同時在細(xì)胞水平和動物模型中發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖的攝取進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞有氧酵解。我們還發(fā)現(xiàn)，在肝癌荷瘤裸鼠動物模型中，c-FLIPL促進(jìn)腫瘤的增殖。
　　2.在肝癌細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)c-FLIPL影響細(xì)胞葡萄糖攝取是通過與SGLT1相互作用，抑制肝癌細(xì)胞中SGLT1蛋白泛素化，抑制SGLT1降

9、解，促進(jìn)肝癌細(xì)胞通過SGLT1主動攝取葡萄糖。
　　3.不同的肝癌細(xì)胞系對低糖的敏感性不同，在肝癌細(xì)胞系HepG2,MHC-97h,Huh-7，SMMC-7721,BEL-7704中，HepG2,MHC-97h,Huh-7對低糖耐受,SMMC-7721,BEL-7704對低糖敏感，在對低糖耐受的細(xì)胞中，SGLT1的表達(dá)較敏感細(xì)胞表達(dá)高。提示SGLT1對細(xì)胞低糖耐受起重要的作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過影響SGLT1促進(jìn)細(xì)胞

10、對低糖的耐受。
　　4.我們通過免疫組化檢測c-FLIPL和SGLT1在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)c-FLIPL和SGLT1在在肝癌組織中的表達(dá)均顯著高于癌旁組織，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)c-FLIPL的表達(dá)與SGLT1的表達(dá)具有正相關(guān)性。同時發(fā)現(xiàn)，在肝癌中c-FLIPL和SGLT1的表達(dá)與肝癌的臨床分期具有正相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　本課題研究發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過抑制肝癌細(xì)胞葡萄糖主動轉(zhuǎn)運(yùn)體SGLT1的降解，促進(jìn)細(xì)胞