豬流行性腹瀉病毒截短S1基因的原核表達(dá)及間接ELISA的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病，以哺乳仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水死亡為主要特征。不同品種和不同年齡的豬對本病均易感，對哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重。1周齡以內(nèi)的哺乳仔豬于開始腹瀉后2-4d死亡，致死率高達(dá)90％以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　研究表明，S

2、基因編碼的S蛋白是PEDV的主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，S蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank公布的CV777S基因序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增出截短S1基因。將擴(kuò)增出的片段克隆到PMD-18-T載體上，通過測序分析證實(shí)該片段與PEDV的S基因序列一致，然后將克隆化截短S1基因亞克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)，獲得了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-S1。將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-S1轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG

3、誘導(dǎo)，表達(dá)了截短S1蛋白。通過優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG的濃度，確定了誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件:誘導(dǎo)時(shí)間為4h，IPTG濃度為0.6mmol/L。經(jīng)表達(dá)形式鑒定，目的蛋白以包涵體的形式存在。重組蛋白經(jīng)Ni柱純化后獲得高純度的重組蛋白，經(jīng)復(fù)性使重組蛋白恢復(fù)活性。Western-blot和ELISA分析表明:重組蛋白與PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明重組蛋白具有反應(yīng)原性。
　　以純化復(fù)性的重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測PEDV抗體的間接E

4、LISA方法，實(shí)驗(yàn)確定了ELISA最佳工作條件:抗原包被濃度為10μg/ml，4℃包被過夜;用5％脫脂奶粉，37℃封閉2h;血清作10240倍稀釋，37℃作用45min;酶標(biāo)二抗按1∶2000稀釋，37℃作用60min; OPD底物溶液37℃避光顯色15min;陰、陽性血清的臨界值為0.125。對該方法進(jìn)行了特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明該檢測PEDV抗體的間接ELISA方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)。運(yùn)用建立的ELISA方法對18