功能納米熒光探針用于腫瘤細(xì)胞成像及診治研究.pdf

1、癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命和社會(huì)發(fā)展的重大疾病,是致人死亡的主要原因之一,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì),因此,癌癥的預(yù)防和治療是目前人類醫(yī)學(xué)健康面臨的最大挑戰(zhàn)。一方面,癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和診斷是預(yù)防和治療癌癥的關(guān)鍵,研究表明若能早期發(fā)現(xiàn)和做出正確診斷,并采取相應(yīng)的治療措施,可極大提高治愈率和生存率。然而,目前的常規(guī)診斷方法特異性和靈敏度較低,在腫瘤發(fā)生早期較難檢測(cè),當(dāng)確診時(shí)腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,從而錯(cuò)過(guò)治療的最佳時(shí)機(jī)。為了盡早發(fā)現(xiàn)和診斷癌癥,

2、研究者致力于在細(xì)胞水平上利用腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)檢測(cè)和識(shí)別腫瘤細(xì)胞。另一方面,為了提高癌癥的治療效果,大量研究集中在開(kāi)發(fā)新的藥物和治療方法,但目前化療還存在許多缺陷,例如化療藥物的毒副作用大、靶向治療效果差、腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生耐藥性等,因此迫切需要我們發(fā)展可控釋放的藥物載體并靶向輸送藥物到腫瘤細(xì)胞,降低藥物的劑量和毒副作用,增強(qiáng)藥物的治療效果,進(jìn)而提高化療的治療效果。
　　近年來(lái),隨著納米科技的不斷發(fā)展,納米熒光探針已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)

3、、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,尤其是腫瘤細(xì)胞的診斷、成像及治療。在這些納米材料中,金納米粒子有著獨(dú)特的光學(xué)特性和生物親和性,因此在生物檢測(cè)、細(xì)胞和活體成像、藥物輸送等方面吸引了人們的廣泛關(guān)注。尤其是高靈敏度、高選擇性對(duì)多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)和成像,是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn),而將多組分檢測(cè)的策略應(yīng)用于生物模型中,實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定是目前研究的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。研究表明目前還沒(méi)有能夠同時(shí)檢測(cè)四種或四種以上腫瘤標(biāo)志物的納米探針被成功應(yīng)用

4、在活細(xì)胞中進(jìn)行生物成像,而且大部分多色納米探針都是檢測(cè)同一類型的腫瘤標(biāo)志物,為了更好地避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn),發(fā)展能同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多種腫瘤標(biāo)志物及不同類型的腫瘤標(biāo)志物的探針并用來(lái)進(jìn)行早期癌癥的診斷是非常必要且有意義的。另外,當(dāng)前的藥物載體主要集中在單一靶向的藥物釋放,無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性識(shí)別和藥物的可控輸送,發(fā)展多重靶向的藥物載體對(duì)于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞內(nèi)的可控釋放、減少用藥量、提高治療效果有著重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值。<

5、br>　　本論文基于細(xì)胞內(nèi)的 mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)以及細(xì)胞表面的受體,利用金納米粒子、DNA和肽鏈,設(shè)計(jì)制備了一系列納米探針并用于腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)、成像、靶向輸送及治療,具體包括:
　　1.基于金納米粒子和DNA分子信標(biāo)設(shè)計(jì)了一種四色納米熒光探針,納米探針組裝以后,熒光團(tuán)的熒光被金納米粒子猝滅,當(dāng)遇到目標(biāo)mRNA后,熒光恢復(fù)。首次實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)四種腫瘤mRNA的同時(shí)檢測(cè)和成像。這個(gè)探針具有響應(yīng)快速、特異性好、抗酶切特性以

6、及好的生物親和性等優(yōu)點(diǎn)。該探針可以有效區(qū)分乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及正常乳腺細(xì)胞和肝細(xì)胞,并能評(píng)估腫瘤mRNA在細(xì)胞中的不同表達(dá)水平。相比較傳統(tǒng)的單一或者雙組分mRNA的檢測(cè),該方法可以更有效地避免假陽(yáng)性結(jié)果,從而提高癌癥早期診斷的準(zhǔn)確性,為癌癥診斷提供更加全面可靠的信息。
　　2.利用分步組裝的方式,將DNA分子信標(biāo)和肽鏈組裝到金納米粒子表面,制備了一種四色納米熒光探針。DNA分子信標(biāo)和肽鏈上的熒光團(tuán)可以被金納米粒子猝滅,當(dāng)遇到目標(biāo)

7、mRNA,分子信標(biāo)會(huì)打開(kāi),熒光得以恢復(fù);在MMP存在時(shí),肽鏈會(huì)被切斷并釋放出熒光,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA和MMP兩種不同類型的腫瘤標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)和成像。該探針首次實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)不同類型的多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)和成像,并能夠區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞以及判斷不同標(biāo)志物表達(dá)水平的變化,既可以防止假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn),同時(shí)也可以提高腫瘤細(xì)胞早期診斷的準(zhǔn)確性。
　　3.基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理,發(fā)展了一種單一波長(zhǎng)激發(fā)同時(shí)檢測(cè)兩種腫瘤標(biāo)志物的方

8、法。在兩個(gè)識(shí)別不同mRNA的分子信標(biāo)上,連接可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的兩個(gè)熒光染料(Alexa Fluor488和Cy3),然后將兩個(gè)分子信標(biāo)組裝到金納米粒子表面,設(shè)計(jì)了一種納米熒光探針(488 nm激發(fā)收集Cy3的熒光)。在一種mRNA存在時(shí),不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào),只有當(dāng)細(xì)胞內(nèi)兩種mRNA都過(guò)表達(dá)時(shí),才能收集到熒光信號(hào),該方法可以在單一波長(zhǎng)激發(fā)下同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的兩種mRNA,有效減少多次激發(fā)造成的細(xì)胞損傷和背景干擾,還可避免單一檢測(cè)可能造

9、成的假陽(yáng)性結(jié)果。
　　4.基于細(xì)胞表面的受體和細(xì)胞內(nèi)的mRNA,發(fā)展了一種雙重靶向的納米載體。在金納米粒子表面組裝上修飾葉酸的DNA和靶向細(xì)胞內(nèi)mRNA的分子信標(biāo),葉酸可以與腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體相結(jié)合增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)納米載體的攝取,分子信標(biāo)莖部的GC序列攜帶阿霉素分子,當(dāng)遇到腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的mRNA時(shí),釋放出藥物分子,達(dá)到雙重靶向的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米載體具有良好的穩(wěn)定性、抗酶切性質(zhì)以及生物親和性,可以有效保護(hù)正常細(xì)胞并殺死腫瘤細(xì)