犬細小病毒VP2基因的克隆、表達及在診斷應用上的研究.pdf

1、犬細小病毒病(Canine Parvovirus disease)是由犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起犬的一種急性傳染病.本病在世界各地均有發(fā)生,各種年齡、品種的犬易感,尤其是斷奶后幼犬的發(fā)病率和死亡率均很高.隨著養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展,對犬病的防控日趨重要.因此,制定積極有效的預防措施,獲得及時準確的診斷信息至關重要. 本試驗通過設計合成特異性引物,擴增CPV VP2基因并進行了原核表達,純化后獲得VP2重組蛋白,以

2、其為包被抗原建立敏感、特異、檢出率高的間接ELISA方法:同時用此方法對抗CPV特異性單抗進行篩選,以獲得了抗CPV VP2特異性單抗. 根據(jù)GenBank公布的CPV VP2基因序列,設計并合成一對特異性引物,以CPV-YM株為模板經(jīng)經(jīng)PCR擴增出VP2基因片斷,將其克隆到pMD18-T載體中.經(jīng)過測序后,將VP2基因亞克隆至原核表達載體pET-30a上,然后轉入表達宿主菌Rosetta中,表達了目的蛋白,表達量為29﹪,分子

3、量約為67ku.通過Western blot證明該重組蛋白具有抗原性.VP2重組蛋白經(jīng)鎳離子親和樹脂純化,純度達到0.7mg/mL. 用VP2重組蛋白作為包被抗原,確定了最佳優(yōu)化條件和結果判定標準.通過特異性試驗證明包被的抗原僅與CPV標準陽性血清發(fā)生反應,不與犬瘟熱、犬腺病毒、犬副粘病毒、波特氏桿菌等疫病的標準陽性血清發(fā)生交叉反應:與進口CPV ELISA試劑盒進行比對,對血清樣品92份的檢測結果表明符合率為97.8﹪;對相同

4、的血清樣品48份進行了4次重復試驗變異系數(shù)小于16﹪.因此本試驗成功的建立了檢測CPV血清抗體的間接ELISA方法.應用該方法對國內(nèi)部分地區(qū)采集的血清樣品227份進行檢測,其中164份為陽性,陽性率為72.25﹪. 以純化的CPV-z株免疫BAL,B/c小鼠,應用雜交瘤技術,采用已建立的間接EIJSA方法篩選獲得了能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞系3株,分別命名為E4F1lF7.E389C4,F10G10AlO.亞類鑒定結