非洲豬瘟病毒p30蛋白的表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、非洲豬瘟(African Swine fever，ASF)屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）要求報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國動(dòng)物病原微生物名錄中將其列為一類動(dòng)物疫病。自上世紀(jì)初，肯尼亞發(fā)生第一期疫情后，陸續(xù)蔓延至非洲、歐洲、美洲、亞洲，嚴(yán)重威脅我國的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，為了防止ASF疫情的突然爆發(fā)，進(jìn)行疫病監(jiān)測刻不容緩。我們有必要建立一種快捷、準(zhǔn)確的方法作為技術(shù)儲備。
　　p30蛋白是ASFV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，由CP204L基因編碼，有強(qiáng)的免疫原決定簇

2、，可作為體液免疫反應(yīng)中非常有效的誘導(dǎo)蛋白，并且在感染后的早期表達(dá)和分泌，常被用于感染后免疫反應(yīng)的早期檢測，與其他ELISA方法相比，p30 rELISA可以提前一周檢測到ASFV特異性抗體。
　　根據(jù)GenBank公布的ASFV基因組序列（登陸號：FR682468）中的CP204L基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出非洲豬瘟病毒p30基因全片段，插入到pOET-1質(zhì)粒中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pOET-p30，將鑒定過的重組質(zhì)粒與桿狀病毒flashBAC

3、 DNA同時(shí)轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。SDS-PAGE和Western Blot分析顯示表達(dá)的重組蛋白大小約為30KDa，能與His標(biāo)簽抗體和非洲豬瘟病毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，該蛋白的表達(dá)為非洲豬瘟ELISA方法的建立提供了抗原。
　　以純化的ASFV p30蛋白作為抗原包被ELISA反應(yīng)板，待檢血清的稀釋倍數(shù)設(shè)置為1:40，通過試驗(yàn)選擇了重組ASFV p30蛋白抗原的最佳包被濃度。結(jié)果表明：重組蛋白最佳包被濃度為200

4、ng/mL。本研究在國內(nèi)首次建立了以真核表達(dá)的p30作為抗原的間接ELISA方法，特異性試驗(yàn)證實(shí)該方法能夠與我國流行的CSF、PRRS、FMD、PRV進(jìn)行鑒別診斷。對臨床24份陰性樣品進(jìn)行檢測計(jì)算出該方法的臨界值為0.2，以此為判定標(biāo)準(zhǔn)對送檢的960份血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性。同時(shí)與國外進(jìn)口成品試劑盒比對，發(fā)現(xiàn)敏感性高于ID-vet公司和SVANOVA公司生產(chǎn)的間接ELISA試劑盒。該方法的建立為我國ASFV的流行病學(xué)調(diào)查提供了一種有