棉花體細胞胚發(fā)生與合子胚發(fā)育相關基因的鑒定、克隆與功能分析.pdf

1、體細胞胚胎發(fā)生是體細胞向胚胎發(fā)生途徑轉變的發(fā)育再建過程，是植物發(fā)育過程中的獨特現象，也是細胞全能性的有力證據和經典示例。體細胞胚胎發(fā)生現象被看作是開展生物學理論研究的良好模型。研究棉花體細胞胚胎發(fā)生對于闡明植物發(fā)育的分子機理，促進作物的遺傳工程改良，無論在基礎理論還是在實際應用價值上都具有極其重要的意義。 1．比較研究了棉花體細胞胚胎發(fā)生過程中的細胞學和內源生化因子動態(tài)變化。首先，通過形態(tài)特征從棉花組織培養(yǎng)中鑒定出了有效胚性能力

2、的細胞系，從而建立有效的再生體系。在細胞水平，結合細胞培養(yǎng)技術應用流式細胞儀鑒定了棉花體細胞脫分化、再分化過程中兩次染色體解旋的細胞學特征標記。同時，對體胚發(fā)生內源激素動態(tài)測定表明，細胞內源生長素IAA及生長素與分裂素比值的急劇增加是非胚性細胞向胚性細胞轉變的一個顯著的生化特征。研究表明，兩次染色體解旋的細胞學活動同內源激素的動態(tài)變化有著共同的規(guī)律和特點，是緊密聯系的，是棉花整個體細胞胚胎發(fā)生過程中脫分化、再分化的細胞學和生化基礎。

3、 2．實現了體胚發(fā)生重要基因資源的成功挖掘，并全面分析了棉花體細胞胚胎發(fā)生過程中的轉錄表達譜，揭示了體細胞胚胎發(fā)生的分子基礎。為了分離參與體細胞胚胎發(fā)生過程有關的基因，采用SSH技術分離了在胚性愈傷組織和各時期胚狀體中差異表達的ESTs。進一步經過兩套差異篩選程序和反向Northern blot分析，最終分離鑒定獲得了671個差異表達的cDNA片段，代表了242個非冗余基因，囊括了以往植物界在本領域研究中分離的體細胞胚胎發(fā)生相關的大

4、部分基因，而且一半以上的基因沒有在以前的體細胞胚胎發(fā)生研究中報道過。其中大約1/3胚胎發(fā)生有關基因是在GenBank中不存在的未知新基因。尤其重要和感興趣的是分離鑒定了很多轉錄調控因子和細胞信號轉導基因，它們很可能在啟動體細胞胚胎發(fā)生過程中起重要作用。又通過cDNA array技術系統(tǒng)地對體細胞胚胎發(fā)生差異表達的相關基因進行了表達譜分析，涉及了體胚分化發(fā)育整個過程，包括胚性細胞分化前后及隨后胚胎發(fā)育的典型時期(球前原胚、球形胚、心形胚、

5、魚雷胚、子葉胚)。揭示了這一發(fā)育過程中存在的幾類不同基因類群及其特異的表達模式，全面闡明了這一獨特的生物發(fā)育過程中的基因特異和有序表達的特點。通過Northern雜交和RT-PCR進一步驗證了不同類型的基因類群在胚胎發(fā)育的不同時期特異表達模式。 3．研究了棉花合子胚形態(tài)發(fā)育進程，鑒定了各個發(fā)育時期的合子胚，構建了六個與棉花生殖發(fā)育相關的差減文庫。包括配子、合子胚、胚乳發(fā)育特異表達 cDNA文庫及體胚與合子胚發(fā)育差異表達 cDNA

6、文庫。重點比較了合子胚發(fā)育起始與體細胞胚發(fā)育早期(胚性起始) 相關基因表達譜特點，研究了兩者發(fā)育起始在基因轉錄表達水平上所存在的分子基礎共性和差異。通過鑒定差異表達基因并結合生物信息學分析表明：在細胞成分、生物過程、分子功能和可能參與的代謝途徑方面，體胚和合子胚發(fā)育的相關基因的表達都具有非常相似的規(guī)律，整體基因表達和代謝過程都存在極大的相似性。即兩者具有相似的形態(tài)發(fā)育過程和分子基礎，也證明了體細胞胚的確可以作為合子胚發(fā)育研究的良好實驗模

7、型。當然，比較也發(fā)現兩者的基因表達也存在一些不同的地方，兩者有著各自特異的功能基因表達和生物代謝過程。 4．借助模式植物擬南芥基因組挖掘預測了生長素應答基因，對其進行了基因組注釋及功能分類、Gene Ontology等相關生物信息學分析。通過檢索相關文獻和數據庫，評估了這一系列假想的生長素應答基因。大概有65.2％的候選基因能夠被證實。該結果和研究數據能夠大大降低基因組中候選生長素應答基因的數目并為很多未知基因提供注釋。更為挖掘

8、新的體細胞胚胎發(fā)生相關激素應答基因提供了基礎。 5．體細胞胚胎發(fā)生過程是一個多因子參與的表達調控復雜而又協同有序互作的分子網絡整體。為了尋找和預測新的體細胞胚胎發(fā)生相關基因，更深的挖掘和理解這一生物過程，利用鑒定的體胚發(fā)生相關基因和生物信息學相結合的方法構建了富含體胚發(fā)生相關因子的分子調控互作網絡，預測了很多生物調控路徑。通過檢索體胚發(fā)生文獻和數據庫，對這一結果進行了評估。很多的實驗證據證明了這一方法和結果的有效性。通過構建基因

9、網絡，發(fā)現細胞死亡和細胞分裂增殖是參與體細胞胚胎發(fā)生這個獨特生物過程的兩個顯著過程，是體胚發(fā)生這一復雜而有序生物過程的核心標志。可以解釋為：兩者相互協調又相互制約的關系很可能決定了體細胞在胚胎發(fā)生過程中的命運。不同激素之間的復雜的互作和動態(tài)平衡關系是體胚發(fā)生中的另一個顯著特征，而且它們以不同的調控方式作用于細胞分裂和細胞死亡這兩個過程。這就表明體胚發(fā)生調控網絡包含了極其復雜的分子調控關系和生物過程。這一草圖為以后的胚胎發(fā)生分子機制和系統(tǒng)

10、生物學研究提供了基礎平臺和參考資料。 6．分離克隆了一系列體細胞胚胎發(fā)生相關候選基因的全長cDNA和部分基因啟動子，通過高通量的功能驗證手段研究了這些重要基因的表達、功能和亞細胞定位信息。利用gateway系列載體(重組技術)大量構建了超量表達載體和RNAi載體，對前面實驗鑒定和構建的基因網絡草圖中發(fā)掘的重要標記基因其進行了功能驗證。一些候選基因在功能驗證實驗中表現了明顯的預期功能表型。進一步對系列基因的啟動子表達特點和細胞瞬時