小鼠胚胎干細胞來源神經(jīng)前體細胞的移植研究及兔脾成纖維樣細胞的多功能性研究.pdf

1、帕金森病(Parikinson's disease,PD)是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,病變主要累及中腦黑質(zhì)致密部,大量多巴胺能神經(jīng)元變性或進行性缺失導致紋狀體內(nèi)多巴胺水平降低,患者在臨床上表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩和肌強直。隨著人類壽命的延長,PD發(fā)病率已明顯上升,然而PD的藥物治療藥效不能持久,同時有副作用的危害,因此以細胞替代為出發(fā)點的干細胞移植療法為PD治療提供了一個新策略。在眾多候選細胞中,胚胎干細胞(ESCs)因其無限的自

2、我更新能力和三胚層分化能力,成為PD治療的理想細胞來源。未分化的ESCs移植研究顯示,雖可引起模型動物的部分功能恢復,同時亦存在畸胎瘤的威脅。ESCs來源的神經(jīng)前體細胞既具有神經(jīng)細胞分化的能力,同時保留了一定的增殖特性,有可能在體內(nèi)持續(xù)呈現(xiàn)其神經(jīng)替代和保護作用。 本文采用無血清、低密度快速誘導ESCs向神經(jīng)前體細胞分化,短期內(nèi)可得到大量可用于移植的細胞。經(jīng)免疫細胞化學和RT-PCR分析表明,這些細胞為高純度的神經(jīng)前體細胞,其分化

3、率接近100％。將所誘導細胞以105植入PD模型小鼠紋狀體后發(fā)現(xiàn),2周始紋狀體內(nèi)就有多巴胺能神經(jīng)元(酪氨酸羥化酶陽性)出現(xiàn),同時HPLC分析表明。2周時紋狀體多巴胺分泌水平顯著增加,與PBS移植組相比存在顯著差異(P<0.05),4周時多巴胺水平有所降低，此外4周時18.75％PD模型鼠移植部位成瘤,經(jīng)組織學分析表明其中含有三胚層來源的多種細胞。以上數(shù)據(jù)說明,這種快速誘導體系可產(chǎn)生有一定功能的神經(jīng)前體細胞,但該高純度前體細胞仍有致瘤性,

4、可能提示該細胞的發(fā)育學地位更加接近于ESCs,對其發(fā)育學表型的進一步探討,將為ES來源的移植級別神經(jīng)前體細胞的研究奠定基礎(chǔ)。 ESCs來源于著床前胚胎的內(nèi)細胞團,其常規(guī)建系和培養(yǎng)都是建立在胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)層和外源LIF的共同作用之下。而MEF體外傳代次數(shù)有限,通常在5-7代,其次,在無外源性LIF的輔助作用時,單獨MEF培養(yǎng)不足以維持小鼠ES細胞的未分化和自我更新特征,另據(jù)最近的報道顯示MEF可能攜帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒,從

5、而存在較大的安全隱患。為此,我們從兔脾中分離到一類成纖維樣細胞(RSF),這類細胞增殖能力是MEF的2-3倍。且體外傳代能力長達13代。最為突出的是這類細胞可在無外源LIF添加的情況下維持小鼠ESCs的生長,目前已支持ESCs生長超過10代,且ESCs能維持其未分化表型,如AKP、SSEA-1、REX1的表達,完整的體內(nèi)外分化潛能,核型分析也表明其具有正常的二倍體核型,40XY。此外經(jīng)透射電鏡分析證實,我們所獲得的RSF細胞未攜帶逆轉(zhuǎn)錄

6、病毒等動物病原體,提示RSF體系是微生物學安全的ESCs培養(yǎng)體系。由此我們可知:RSF來源廣泛,簡便易得,體外增殖能力強,同時不需外源LIF的輔助作用,還是微生物安全的培養(yǎng)體系,可望替代MEF成為ESCs新的培養(yǎng)體系,并且該體系價廉,易得,數(shù)量充足,有較大的推廣價值,必將有力推動ESCs的基礎(chǔ)和臨床應用研究。成纖維細胞與間充質(zhì)干細胞(MSC)形態(tài)相似,且均為中胚層來源,而后者已顯示出多種分化潛能,故而為探討RSF的分化潛能,我們對其進行

7、了成骨、成脂、平滑肌誘導和肝細胞誘導的初步研究。經(jīng)AKP和Von Kossa染色表明,RSF可誘導為成骨細胞。RT-PCR分析也進一步證實了其成骨潛能；油紅染色顯示,經(jīng)常規(guī)脂肪誘導和低血清bFGF誘導,均可引起高比例脂肪細胞分化：糖原染色證實RSF亦可跨胚層分化為肝細胞；此外RT-PCR顯示,RA誘導RSF細胞平滑肌分化后,有平滑肌特異標志物表達。 綜上所述,我們所獲得的RSF細胞是一類具有多功能性的細胞,不但顯示出強大的ESC