產(chǎn)甲烷菌抑制劑對單胃動物后腸微生物代謝的影響.pdf

1、近年來，越來越多的報道將人們注意力集中到單胃動物后腸甲烷氣體主要生產(chǎn)者一產(chǎn)甲烷菌，產(chǎn)甲烷菌利用飼料中營養(yǎng)物質(zhì)代謝并最終生成甲烷氣體排出體外，其產(chǎn)生過程一定程度影響宿主的能量代謝。本論文主要關注了抑制單胃動物后腸產(chǎn)甲烷菌對后腸菌群代謝的影響。首先設計了體外發(fā)酵模型來監(jiān)測抑制接種糞樣中產(chǎn)甲烷菌后對發(fā)酵過程中產(chǎn)氣、產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）的影響。隨后，以三元雜交仔豬為模型動物，通過口腔灌注產(chǎn)甲烷菌抑制劑

2、溴氯甲烷（Bromochloromethane，BCM），觀察了后腸產(chǎn)甲烷菌被抑制后，菌群結(jié)構(gòu)及揮發(fā)性脂肪酸濃度的變化。最后，以小鼠為動物模型，通過飲水添加BCM，研究甲烷菌抑制劑和高脂日糧對小鼠生長、盲腸菌群結(jié)構(gòu)、VFA濃度、血清指標以及肝臟脂肪代謝相關基因的表達的影響。
　　1.甲烷菌抑制劑對豬糞樣微生物體外發(fā)酵不同底物的影響
　　研究發(fā)現(xiàn)，豬后腸中也存在產(chǎn)甲烷菌，然而目前我們對其在豬后腸中的作用了解還不多。本試驗利用體

3、外發(fā)酵技術，通過用甲烷菌抑制劑抑制產(chǎn)甲烷菌研究其對豬糞中微生物發(fā)酵不同底物的影響。采集斷奶仔豬新鮮糞樣作為接種菌來源，以果寡糖（Fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）、苜蓿、果膠、小麥麩、小麥淀粉等飼料原料作培養(yǎng)基發(fā)酵底物進行體外發(fā)酵，記錄產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)生量，測定發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸濃度。結(jié)果表明，發(fā)酵36h后有機物校正產(chǎn)氣量(Organic matter calibration gas production，OMCV)、產(chǎn)

4、氣量到達總量1/2的時間(T1/2)、發(fā)酵過程中最快產(chǎn)氣速度（Rmax）以及到達最快產(chǎn)氣速度的時間（Tmax）均受到底物的極顯著影響（P＜0.01）;除OMCV外（P＞0.05），均極顯著受抑制劑影響(P＜0.01);并且受到抑制劑與底物互作效應的影響(P＜0.01)。不同底物甲烷產(chǎn)生量高低順序為:苜蓿組＞麩皮組＞果膠組＞FOS組＞淀粉組。
　　2.灌胃BCM對仔豬糞樣微生物區(qū)系及揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響
　　本試驗旨在研究產(chǎn)

5、甲烷菌抑制劑BCM對仔豬糞樣微生物區(qū)系以及糞樣VFA濃度的影響。選取18頭38日齡（斷奶后10天）雌性杜長大三元斷奶仔豬，隨機分成2個組:口腔灌喂BCM的處理組和灌喂生理鹽水的對照組，每組9個重復，每個重復一頭仔豬。試驗期為40天，每10天記錄體重，試驗期結(jié)束，采集仔豬糞樣，提取核酸，使用變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和real-timePCR研究其菌群結(jié)構(gòu)，

6、氣相色譜法分析糞樣中揮發(fā)性脂肪酸含量。結(jié)果表明，BCM處理對仔豬體增重無顯著影響;DGGE圖譜中不同日齡組，不同處理組樣品聚于不同簇，但各組總細菌和產(chǎn)甲烷菌拷貝數(shù)無顯著差異。BCM處理組仔豬糞樣中異丁酸占總揮發(fā)酸比例顯著降低(P＜0.05); BCM處理顯著增加仔豬糞樣丙酸比例(P＜0.05)。結(jié)果提示，日齡對糞樣微生物和揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生的影響較大，而添加BCM的作用效果不明顯。
　　3.高脂肪日糧和產(chǎn)甲烷菌抑制劑對C57BL/6

7、J小鼠盲腸微生物及脂肪代謝的影響
　　本試驗旨在研究產(chǎn)甲烷菌抑制劑BCM對采食高、低脂肪水平日糧小鼠的腸道微生物以及脂肪代謝的影響。選取32只21日齡的雌性C57BL/6J小鼠，隨機分成4組:對照低脂日糧組、對照低脂日糧加BCM組、高脂日糧組及高脂日糧加BCM組，每組8個重復，BCM通過飲水添加。飼養(yǎng)周期為6周，試驗期結(jié)束，采集小鼠血液樣品，用于生化指標分析;采集小鼠盲腸內(nèi)容物，使用變性梯度凝膠電泳技術及real-timePCR等

8、分子技術研究其菌群結(jié)構(gòu);氣相色譜法分析糞樣中揮發(fā)性脂肪酸含量;real-timePCR技術分析肝臟中脂肪代謝相關基因表達。高脂日糧和BCM處理對小鼠體增重均無顯著影響;DGGE圖譜中低脂日糧組和高脂日糧組樣品聚于不同簇，但對各組總細菌、產(chǎn)甲烷菌和硫還原菌數(shù)量無顯著影響。高脂日糧組糞樣中乙酸的比例顯著降低（P＜0.05）;BCM處理顯著增加小鼠糞樣丙酸比例（P＜0.05）;高脂日糧處理顯著影響高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和總膽固