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文檔簡介
1、目的:腎癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤,約有三分之一的腎癌患者在發(fā)現(xiàn)時即已為晚期。轉移性腎癌目前尚無有效治療方法,五年生存率不到20%,嚴重影響我國人民的生命健康。CXCR4是一種趨化因子,在機體內發(fā)揮著重要的生理病理功能。國內外大量研究證據(jù)表明CXCR4與腫瘤轉移有關,現(xiàn)在認為其活化后可以激活下游多種信號通路從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本實驗指在探尋CXCR4在腎癌細胞中相互作用的蛋白和DNA,豐富CXCR4促進腎癌轉移的通路。
方法:
2、
1.課題組已構建包裝高表達CXCR4-EGFP的慢病毒載體,轉染病毒得到過表達CXCR4的腎癌細胞系ACHN,并通過實時熒光顯微鏡和定量PCR驗證轉染效果。
2.利用蛋白質免疫共沉淀、染色質免疫共沉淀技術檢測ACHN細胞內與CXCR4相互作用的蛋白和DNA,通過質譜分析和測序分別測定細胞內與ACHN相互作用的蛋白和DNA。
3.針對質譜分析的結果進行驗證。質譜分析得到與CXCR4結合的蛋白有eEF1A1(
3、Eukrryotic Translation Elongation Factor1 Alpha1,eEF1A1)。設計相對應的siRNA使其低表達,包裝干擾慢病毒,轉染,構建穩(wěn)定低表達的ACHN細胞系。
4.通過細胞增殖實驗、細胞凋亡實驗、細胞遷移和實驗研究其與腎癌轉移的關系。進行細胞功能實驗,對轉染EGFP慢病毒的ACHN細胞,eEF1A1干擾的ACHN-EGFP細胞,高表達CXCR4的ACHN-CXCR4細胞及干擾eEF1
4、A1的ACHN-CXCR4細胞進行CCK8增殖、流式細胞凋亡、Transwell細胞遷移實驗,探討eEF1A1對腎癌細胞功能的影響,并通過比較在CXCR4高表達時敲低eEF1A1表達來初步探討CXCR4與eEF1A1相互作用對腎癌細胞功能的影響。
5.選取98例腎癌標本構建組織芯片,進行免疫組化染色,統(tǒng)計各標本eEF1A1表達量的高低,結合患者的預后,初步探討eEF1A1與腎癌預后的關系。
結果:
1.構建
5、過表達CXCR4-EGFP融合蛋白的腎癌細胞系ACHN構建成功。轉染ACHN細胞,熒光顯微鏡下可見ACHN細胞>90%發(fā)出綠色熒光,實時定量PCR顯示轉染CXCR4-EGFP過表達病毒后ACHN內CXCR4表達量提高7499倍,蛋白質免疫印跡顯示融合蛋白大量表達。
2.免疫共沉淀獲取和CXCR4相互作用的蛋白質,跑膠后送質譜分析,質譜分析提示約在50KDa位置存在條帶可能是eEF1A1。進一步通過western驗證此結論,在5
6、0KDa附近位置加入eEF1A1一抗,有明確條帶顯示,證實腎癌細胞系ACHN內CXCR4與eEF1A1存在相互作用。
3.通過查詢基因數(shù)據(jù)庫,設計eEF1A1的干擾RNA,干擾序列為GCACCAUGAAGCUUUGAGUGAAGCTTGCUUCACUCAAAGCUUCAUGGUGCTT。此序列構建shRNA干擾慢病毒并轉染ACHN細胞和ACHN-CXCR4細胞,并通過實時定量PCR和western驗證干擾效率約為70%,即干擾
7、組eEF1A1的表達量下調70%,至此構建eEF1A1干擾慢病毒并構建穩(wěn)定轉染的ACHN細胞系成功。
4.細胞功能實驗證實干擾eEF1A1后腎癌細胞的凋亡稍增加,增殖減慢,遷移無明顯變化。高表達CXCR4的ACHN-CXCR4在干擾掉eEF1A1后凋亡明顯增加,增殖減慢幅度更大,而遷移能力無明顯變化。提示eEF1A1增強了腎癌細胞的增殖能力,而其部分機制可能是通過與CXCR4相互作用實現(xiàn)的。而eEF1A1對腎癌細胞的遷移能力無
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