CXCR4與eEF1A1相互作用與腎癌轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、目的：腎癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，約有三分之一的腎癌患者在發(fā)現(xiàn)時即已為晚期。轉(zhuǎn)移性腎癌目前尚無有效治療方法，五年生存率不到20％，嚴重影響我國人民的生命健康。CXCR4是一種趨化因子，在機體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理病理功能。國內(nèi)外大量研究證據(jù)表明CXCR4與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，現(xiàn)在認為其活化后可以激活下游多種信號通路從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本實驗指在探尋CXCR4在腎癌細胞中相互作用的蛋白和DNA，豐富CXCR4促進腎癌轉(zhuǎn)移的通路。
　　方法：

2、
　　1.課題組已構(gòu)建包裝高表達CXCR4-EGFP的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染病毒得到過表達CXCR4的腎癌細胞系A(chǔ)CHN，并通過實時熒光顯微鏡和定量PCR驗證轉(zhuǎn)染效果。
　　2.利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測ACHN細胞內(nèi)與CXCR4相互作用的蛋白和DNA，通過質(zhì)譜分析和測序分別測定細胞內(nèi)與ACHN相互作用的蛋白和DNA。
　　3.針對質(zhì)譜分析的結(jié)果進行驗證。質(zhì)譜分析得到與CXCR4結(jié)合的蛋白有eEF1A1(

3、Eukrryotic Translation Elongation Factor1 Alpha1，eEF1A1)。設(shè)計相對應(yīng)的siRNA使其低表達，包裝干擾慢病毒，轉(zhuǎn)染，構(gòu)建穩(wěn)定低表達的ACHN細胞系。
　　4.通過細胞增殖實驗、細胞凋亡實驗、細胞遷移和實驗研究其與腎癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。進行細胞功能實驗，對轉(zhuǎn)染EGFP慢病毒的ACHN細胞，eEF1A1干擾的ACHN-EGFP細胞，高表達CXCR4的ACHN-CXCR4細胞及干擾eEF1

4、A1的ACHN-CXCR4細胞進行CCK8增殖、流式細胞凋亡、Transwell細胞遷移實驗，探討eEF1A1對腎癌細胞功能的影響，并通過比較在CXCR4高表達時敲低eEF1A1表達來初步探討CXCR4與eEF1A1相互作用對腎癌細胞功能的影響。
　　5.選取98例腎癌標本構(gòu)建組織芯片，進行免疫組化染色，統(tǒng)計各標本eEF1A1表達量的高低，結(jié)合患者的預(yù)后，初步探討eEF1A1與腎癌預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建

5、過表達CXCR4-EGFP融合蛋白的腎癌細胞系A(chǔ)CHN構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染ACHN細胞，熒光顯微鏡下可見ACHN細胞＞90％發(fā)出綠色熒光，實時定量PCR顯示轉(zhuǎn)染CXCR4-EGFP過表達病毒后ACHN內(nèi)CXCR4表達量提高7499倍，蛋白質(zhì)免疫印跡顯示融合蛋白大量表達。
　　2.免疫共沉淀獲取和CXCR4相互作用的蛋白質(zhì)，跑膠后送質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析提示約在50KDa位置存在條帶可能是eEF1A1。進一步通過western驗證此結(jié)論，在5

6、0KDa附近位置加入eEF1A1一抗，有明確條帶顯示，證實腎癌細胞系A(chǔ)CHN內(nèi)CXCR4與eEF1A1存在相互作用。
　　3.通過查詢基因數(shù)據(jù)庫，設(shè)計eEF1A1的干擾RNA，干擾序列為GCACCAUGAAGCUUUGAGUGAAGCTTGCUUCACUCAAAGCUUCAUGGUGCTT。此序列構(gòu)建shRNA干擾慢病毒并轉(zhuǎn)染ACHN細胞和ACHN-CXCR4細胞，并通過實時定量PCR和western驗證干擾效率約為70％，即干擾

7、組eEF1A1的表達量下調(diào)70％，至此構(gòu)建eEF1A1干擾慢病毒并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ACHN細胞系成功。
　　4.細胞功能實驗證實干擾eEF1A1后腎癌細胞的凋亡稍增加，增殖減慢，遷移無明顯變化。高表達CXCR4的ACHN-CXCR4在干擾掉eEF1A1后凋亡明顯增加，增殖減慢幅度更大，而遷移能力無明顯變化。提示eEF1A1增強了腎癌細胞的增殖能力，而其部分機制可能是通過與CXCR4相互作用實現(xiàn)的。而eEF1A1對腎癌細胞的遷移能力無