Smad4的條件性缺失對T細胞活化的影響.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β)超家族是一類多功能的多肽,在維持T細胞免疫的過程中發(fā)揮重要的作用,能夠影響T細胞的發(fā)育、分化和增殖等各個環(huán)節(jié)。在哺乳動物體內(nèi),TGF-β亞類包括3種亞型,即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。其中,TGF-β1在機體免疫系統(tǒng)中廣泛存在并且發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)內(nèi)淋巴細胞及非淋巴細胞的活化及效應(yīng)細胞的功能。TGF-β1發(fā)揮其在細胞水平

2、的功能是通過與其異質(zhì)性的復(fù)合物組成的TGF-β受體Ⅰ及受體Ⅱ介導(dǎo)的受體偶聯(lián)絲氨酸/蘇氨酸激酶進行信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad(SmaandMadHomologue)蛋白家族是TGF-β受體的底物之一,目前認為Smad蛋白家族包括八個成員:TGF-β通路中的R-Smad包括Smad2及Smad3;BMP通路中的R-Smad包括Smad1、Smad5及Smad8;Co-Smad即Smad4;兩個I-Smads包括Smad6和Smad7。
　　

3、Smad4蛋白是TGF-β/Smad信號通路在細胞內(nèi)傳導(dǎo)過程中最重要的中介分子之一。在TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,Smad2和Smad3能夠被其C端受體介導(dǎo)的磷酸化所激活。Smad2和Smad3經(jīng)過受體誘導(dǎo)的磷酸化活化之后,能夠與Smad4形成雜聚體,轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞核內(nèi)。在細胞核內(nèi)該聚合體能夠與轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白及阻遏蛋白相結(jié)合,從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在過去的幾年里有大量的證據(jù)表明,接受TGF-β信號刺激后Smad4能夠與

4、Smad2和Smad3形成Smad2/Smad2/Smad4、Smad3/Smad3/Smad4以及Smad2/Smad3/Smad4聚合體,并且認為Smad4是TGF-β信號通路中唯一的Co-Smad而發(fā)揮著協(xié)助Smad2和Smad3進入細胞核發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白分子。然而,在2006年He等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了另外一種蛋白分子——轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1γ(TranscriptionalIntermediaryFactor1γ,TIF1γ),能夠與

5、Smad4競爭結(jié)合磷酸化活化的Smad2、Smad3,介導(dǎo)該聚合體進入細胞內(nèi)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。除了TGF-β/Smad信號通路,TGF-β還能夠激活非Smad信號通路,包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinase,ERK)、c-Jun氨基端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)和p38激活的蛋白激酶信號通路。
　　盡管Smad4蛋白是TGF-β/Smad信號通路中

6、一個重要的分子,而TGF-β在維持T細胞免疫過程中起著重要的作用,目前關(guān)于Smad4蛋白缺失對T細胞免疫影響的研究卻很少。我們的研究主要的目的就是利用Smad4條件性缺失小鼠模型,探索Smad4對于T細胞增殖、活化和效應(yīng)T細胞的分化過程是否有著與TGF-β同樣重要的作用。鑒于Smad4完全敲除的小鼠由于外胚層形成的缺陷在胚胎早期就會死亡,我們引進了利用Cre-loxP系統(tǒng)的Smad4基因T細胞條件性敲除的小鼠(Smad4Cre/Co/C

7、o)作為動物模型,Smad4條件基因打靶小鼠(Smad4Co/Co)作為對照。
　　1.研究目的和內(nèi)容
　　1)Smad4條件性缺失對T細胞發(fā)育和增殖的影響
　　TGF-β最早被發(fā)現(xiàn)的功能是它能夠?qū)⒓毎芷谧铚贕1期,從而發(fā)揮它對各種細胞的抑制作用,其中也包括了免疫系統(tǒng)的T細胞。而有研究認為,Smad4蛋白在TGF-β發(fā)揮對細胞周期的阻滯功能過程中處于中樞地位,Smad4通過與R-Smad聚合體在細胞核內(nèi)抑制有絲分裂

8、信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)細胞周期。因此,我們的研究目的之一就是探討Smad4對T細胞發(fā)育和增殖的影響,以及Smad4條件性缺失小鼠模型是否會造成T細胞發(fā)育不完全和對T增殖抑制作用的消失。
　　2)Smad4條件性缺失對T細胞活化和分化的影響
　　研究表明,TGF-β通過促進CD4+CD25+Treg細胞的發(fā)育和分化來發(fā)揮其抑制其他T細胞的活化及分化的功能,CD4+CD25+Treg能夠分泌TGF-β1或表達膜結(jié)合型的TGF-β1繼而

9、抑制其它免疫細胞的活化和分化。因此,我們的研究內(nèi)容之一是觀察Smad4條件性缺失小鼠模型T細胞活化和分化的過程是否與對照組小鼠有著顯著性的差異。
　　3)Smad4條件性缺失對CD8+T細胞活化和增殖的影響
　　在研究過程中我們發(fā)現(xiàn),年老的Smad4條件性缺失小鼠CD8+T細胞的活化能力有缺陷,而其增殖能力與對照組小鼠相比沒有明顯的差別。在接下來的工和作中我們利用尾靜脈注射李斯特菌的方法建立動物模型,在用李斯特菌免疫0天、5

10、天、7天后研究活化的CD8+CD44hiT細胞比例Smad4Cre/Co/Co和Smad4Co/Co小鼠之間有無顯著性差別。
　　4)Smad4條件性缺失對CD8+效應(yīng)CTL的影響
　　目前,關(guān)于Smad4與抗原特異性CD8+T細胞的研究還未見報道,而CD8+T細胞在早期李斯特菌感染的清除過程中起著重要的作用。因此,這部分我們的研究內(nèi)容主要是Smad4條件性缺失對CD8+效應(yīng)CTL的影響及其機制。
　　2.研究方法

11、r>　　1)PCR鑒定Smad4基因型
　　小鼠尾部組織提取基因組DNA作為模板,PCR反應(yīng)條件:94°C,1分鐘;68°C,1分鐘20秒;72°C,30秒;94°C,2分鐘;94°C,30秒,60°C,30秒,72°C,1分鐘,30個循環(huán);72°C,8分鐘;4°C,保存。
　　1)ImmunoblottingAnalysis
　　M2buffer裂解,蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳、蛋白轉(zhuǎn)印、封閉、一抗孵育、二抗

12、孵育和辣根過氧化物酶-ECL法檢測其中Smad4蛋白含量。
　　2)流式細胞術(shù)
　　用熒光標記的單抗對待檢測表面Marker進行標記,1％多聚甲醛固定,上機FACS檢測其表達水平。
　　對細胞內(nèi)細胞因子檢測,則需要將待檢細胞用PMA/Ino/BFA處理4h后,先對表面Marker進行標記,用透化液處理后,用熒光抗體標記胞內(nèi)因子,上機FACS檢測其表達水平。
　　3)統(tǒng)計
　　組間差異比較使用t檢驗,以P<0

13、.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4)其它
　　本實驗使用了細胞計數(shù)、FITC-標記的AnnexinV、CFSE以及BrdU摻入等方法檢測細胞的增殖能力。
　　3.研究結(jié)果和結(jié)論
　　1)基因型鑒定
　　我們用DNA鑒定、Western-Blot和熒光抗體染色的方法證實了引進的確實是Smad4基因T細胞條件性敲除小鼠。
　　2)Smad4條件性缺失對T細胞發(fā)育和分化的影響
　　我們的實驗沒有發(fā)現(xiàn)S

14、mad4基因的T細胞條件性敲除對Treg細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞發(fā)育有顯著的影響,同樣的,我們發(fā)現(xiàn)Smad4基因條件性缺失對Th1/Th2/Th17細胞的分化也沒有顯著性的影響。
　　3)Smad4條件性缺失對T細胞增殖的影響
　　Smad4條件性缺失對幼年小鼠CD4+和CD8+T細胞數(shù)目沒有影響,對年老小鼠脾細胞總數(shù)和CD4+T細胞數(shù)目也沒有影響,而我們發(fā)現(xiàn)Smad4Cre/Co/Co與Smad4Co/Co相比

15、CD8+T細胞數(shù)卻有著顯著性的差別,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因尚不明確。
　　4)Smad4條件性缺失對T細胞活化的影響
　　對新生小鼠脾細胞和年老(52周齡)小鼠的脾、淋巴結(jié)細胞的分析,我們發(fā)現(xiàn)Smad4Co/Co與Smad4Cre/Co/Co相比CD4+CD44hi細胞比例均沒有顯著性差異。而在對年老小鼠脾細胞進行分析時發(fā)現(xiàn),Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細胞中CD8+CD44hi細胞低于對照組小鼠,說明Smad4條件性缺失

16、對CD8+T細胞的活化有一定影響。
　　5)Smad4條件性缺失對胃腸道上皮穩(wěn)態(tài)的影響
　　曾有研究發(fā)現(xiàn),用Lck-Cre的方法T細胞條件性敲除Smad4基因小鼠在年老時會出現(xiàn)胃腸道多發(fā)性的腫瘤;而另有研究表明,以Lck-Cre或CD4-Cre技術(shù)T細胞特異性Smad4條件性敲除小鼠在年老時只會在十二指腸部位出現(xiàn)上皮細胞性腫瘤。在我們的研究中,對52周齡的Smad4條件性敲除小鼠肝、十二指腸和結(jié)腸病理切片,HE染色分析,并未

17、發(fā)現(xiàn)有胃腸道腫瘤的發(fā)生。我們推測,Smad4基因T細胞條件性缺失不一定會造成胃腸道的腫瘤,Smad4基因T細胞條件性缺失造成胃腸道的腫瘤的發(fā)生與否可能與基因型及飼養(yǎng)環(huán)境有著密切的關(guān)系。
　　6)Smad4條件性缺失對CD8+效應(yīng)CTL的影響
　　我們使用李斯特菌感染小鼠模型誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細胞免疫應(yīng)答,探討Smad4基因T細胞條件性敲除對CD8+T細胞活化的影響。在研究過程中我們發(fā)現(xiàn),Smad4基因條件性缺失會導(dǎo)致C

18、D8+效應(yīng)CTL細胞活化明顯滯后,李斯特菌尾靜脈注射5天時Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細胞中CD8+CD44hi細胞低于對照組小鼠,而在7天時這種顯著性差異消失。我們在研究中,發(fā)現(xiàn)李斯特菌感染Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細胞中CD8+T細胞的GranB、IFN-γ等殺傷Marker水平要遠遠低于對照組小鼠,同時Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細胞中短期效應(yīng)細胞CD127(low)/KLRG1(hi)CD8+T細胞的比例也低

19、于對照組小鼠,說明Smad4基因條件性缺失對CD8+效應(yīng)CTL細胞的殺傷功能有一定的影響。
　　7)Smad4條件性缺失小鼠影響CD8+CTL活化和殺傷效應(yīng)的機制
　　我們在實驗中發(fā)現(xiàn),Smad4基因的T細胞條件性缺失對抗原特異性CD8+T細胞表面的IL-2Rα鏈、β鏈、γ鏈以及IL-15Rα鏈表達并沒有顯著的影響,因此,李斯特菌誘導(dǎo)的Smad4基因T細胞條件性敲除小鼠(Smad4Cre/Co/Co)脾細胞中CD8+T細胞活

20、化滯后并不是由于其細胞表面IL-2R及IL-15R的異常表達所造成的。研究中發(fā)現(xiàn)Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細胞中CD43+CD27+細胞的比例明顯低于對照組小鼠,而CD43+CD27+細胞對CD8+效應(yīng)CTL活化和功能維持有重要的作用,我們推測這是造成其CD8+CTL活化滯后和殺傷效應(yīng)缺陷的原因之一。在體外實驗中,我們用體外增殖分化實驗排除了Smad4條件性缺失造成的抗原特異性CD8+T細胞之間的差別是由于CD8+T細胞內(nèi)在的缺

21、陷的影響。而接下來的實驗顯示,Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細胞中CD4+T細胞表面的CD40L表達低于對照組小鼠,CD40與CD40L的相互作用能夠誘導(dǎo)CD80/CD86共刺激信號的表達,繼而活化pre-CTL。因此,我們認為Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細胞中CD4+T細胞表面的CD40L低表達是造成CD8+CTL活化滯后的另外一個原因。
　　4.本文創(chuàng)新點
　　關(guān)于Smad4對CTL細胞分化有何影響的研究目前還