Smad4的條件性缺失對(duì)T細(xì)胞活化的影響.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β)超家族是一類多功能的多肽,在維持T細(xì)胞免疫的過程中發(fā)揮重要的作用,能夠影響T細(xì)胞的發(fā)育、分化和增殖等各個(gè)環(huán)節(jié)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),TGF-β亞類包括3種亞型,即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。其中,TGF-β1在機(jī)體免疫系統(tǒng)中廣泛存在并且發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)內(nèi)淋巴細(xì)胞及非淋巴細(xì)胞的活化及效應(yīng)細(xì)胞的功能。TGF-β1發(fā)揮其在細(xì)胞水平

2、的功能是通過與其異質(zhì)性的復(fù)合物組成的TGF-β受體Ⅰ及受體Ⅱ介導(dǎo)的受體偶聯(lián)絲氨酸/蘇氨酸激酶進(jìn)行信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad(SmaandMadHomologue)蛋白家族是TGF-β受體的底物之一,目前認(rèn)為Smad蛋白家族包括八個(gè)成員:TGF-β通路中的R-Smad包括Smad2及Smad3;BMP通路中的R-Smad包括Smad1、Smad5及Smad8;Co-Smad即Smad4;兩個(gè)I-Smads包括Smad6和Smad7。
　　

3、Smad4蛋白是TGF-β/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)過程中最重要的中介分子之一。在TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,Smad2和Smad3能夠被其C端受體介導(dǎo)的磷酸化所激活。Smad2和Smad3經(jīng)過受體誘導(dǎo)的磷酸化活化之后,能夠與Smad4形成雜聚體,轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核內(nèi)該聚合體能夠與轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白及阻遏蛋白相結(jié)合,從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在過去的幾年里有大量的證據(jù)表明,接受TGF-β信號(hào)刺激后Smad4能夠與

4、Smad2和Smad3形成Smad2/Smad2/Smad4、Smad3/Smad3/Smad4以及Smad2/Smad3/Smad4聚合體,并且認(rèn)為Smad4是TGF-β信號(hào)通路中唯一的Co-Smad而發(fā)揮著協(xié)助Smad2和Smad3進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白分子。然而,在2006年He等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了另外一種蛋白分子——轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1γ(TranscriptionalIntermediaryFactor1γ,TIF1γ),能夠與

5、Smad4競爭結(jié)合磷酸化活化的Smad2、Smad3,介導(dǎo)該聚合體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。除了TGF-β/Smad信號(hào)通路,TGF-β還能夠激活非Smad信號(hào)通路,包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinase,ERK)、c-Jun氨基端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)和p38激活的蛋白激酶信號(hào)通路。
　　盡管Smad4蛋白是TGF-β/Smad信號(hào)通路中

6、一個(gè)重要的分子,而TGF-β在維持T細(xì)胞免疫過程中起著重要的作用,目前關(guān)于Smad4蛋白缺失對(duì)T細(xì)胞免疫影響的研究卻很少。我們的研究主要的目的就是利用Smad4條件性缺失小鼠模型,探索Smad4對(duì)于T細(xì)胞增殖、活化和效應(yīng)T細(xì)胞的分化過程是否有著與TGF-β同樣重要的作用。鑒于Smad4完全敲除的小鼠由于外胚層形成的缺陷在胚胎早期就會(huì)死亡,我們引進(jìn)了利用Cre-loxP系統(tǒng)的Smad4基因T細(xì)胞條件性敲除的小鼠(Smad4Cre/Co/C

7、o)作為動(dòng)物模型,Smad4條件基因打靶小鼠(Smad4Co/Co)作為對(duì)照。
　　1.研究目的和內(nèi)容
　　1)Smad4條件性缺失對(duì)T細(xì)胞發(fā)育和增殖的影響
　　TGF-β最早被發(fā)現(xiàn)的功能是它能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在G1期,從而發(fā)揮它對(duì)各種細(xì)胞的抑制作用,其中也包括了免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞。而有研究認(rèn)為,Smad4蛋白在TGF-β發(fā)揮對(duì)細(xì)胞周期的阻滯功能過程中處于中樞地位,Smad4通過與R-Smad聚合體在細(xì)胞核內(nèi)抑制有絲分裂

8、信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。因此,我們的研究目的之一就是探討Smad4對(duì)T細(xì)胞發(fā)育和增殖的影響,以及Smad4條件性缺失小鼠模型是否會(huì)造成T細(xì)胞發(fā)育不完全和對(duì)T增殖抑制作用的消失。
　　2)Smad4條件性缺失對(duì)T細(xì)胞活化和分化的影響
　　研究表明,TGF-β通過促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的發(fā)育和分化來發(fā)揮其抑制其他T細(xì)胞的活化及分化的功能,CD4+CD25+Treg能夠分泌TGF-β1或表達(dá)膜結(jié)合型的TGF-β1繼而

9、抑制其它免疫細(xì)胞的活化和分化。因此,我們的研究內(nèi)容之一是觀察Smad4條件性缺失小鼠模型T細(xì)胞活化和分化的過程是否與對(duì)照組小鼠有著顯著性的差異。
　　3)Smad4條件性缺失對(duì)CD8+T細(xì)胞活化和增殖的影響
　　在研究過程中我們發(fā)現(xiàn),年老的Smad4條件性缺失小鼠CD8+T細(xì)胞的活化能力有缺陷,而其增殖能力與對(duì)照組小鼠相比沒有明顯的差別。在接下來的工和作中我們利用尾靜脈注射李斯特菌的方法建立動(dòng)物模型,在用李斯特菌免疫0天、5

10、天、7天后研究活化的CD8+CD44hiT細(xì)胞比例Smad4Cre/Co/Co和Smad4Co/Co小鼠之間有無顯著性差別。
　　4)Smad4條件性缺失對(duì)CD8+效應(yīng)CTL的影響
　　目前,關(guān)于Smad4與抗原特異性CD8+T細(xì)胞的研究還未見報(bào)道,而CD8+T細(xì)胞在早期李斯特菌感染的清除過程中起著重要的作用。因此,這部分我們的研究內(nèi)容主要是Smad4條件性缺失對(duì)CD8+效應(yīng)CTL的影響及其機(jī)制。
　　2.研究方法

11、r>　　1)PCR鑒定Smad4基因型
　　小鼠尾部組織提取基因組DNA作為模板,PCR反應(yīng)條件:94°C,1分鐘;68°C,1分鐘20秒;72°C,30秒;94°C,2分鐘;94°C,30秒,60°C,30秒,72°C,1分鐘,30個(gè)循環(huán);72°C,8分鐘;4°C,保存。
　　1)ImmunoblottingAnalysis
　　M2buffer裂解,蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳、蛋白轉(zhuǎn)印、封閉、一抗孵育、二抗

12、孵育和辣根過氧化物酶-ECL法檢測其中Smad4蛋白含量。
　　2)流式細(xì)胞術(shù)
　　用熒光標(biāo)記的單抗對(duì)待檢測表面Marker進(jìn)行標(biāo)記,1％多聚甲醛固定,上機(jī)FACS檢測其表達(dá)水平。
　　對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測,則需要將待檢細(xì)胞用PMA/Ino/BFA處理4h后,先對(duì)表面Marker進(jìn)行標(biāo)記,用透化液處理后,用熒光抗體標(biāo)記胞內(nèi)因子,上機(jī)FACS檢測其表達(dá)水平。
　　3)統(tǒng)計(jì)
　　組間差異比較使用t檢驗(yàn),以P<0

13、.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4)其它
　　本實(shí)驗(yàn)使用了細(xì)胞計(jì)數(shù)、FITC-標(biāo)記的AnnexinV、CFSE以及BrdU摻入等方法檢測細(xì)胞的增殖能力。
　　3.研究結(jié)果和結(jié)論
　　1)基因型鑒定
　　我們用DNA鑒定、Western-Blot和熒光抗體染色的方法證實(shí)了引進(jìn)的確實(shí)是Smad4基因T細(xì)胞條件性敲除小鼠。
　　2)Smad4條件性缺失對(duì)T細(xì)胞發(fā)育和分化的影響
　　我們的實(shí)驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)S

14、mad4基因的T細(xì)胞條件性敲除對(duì)Treg細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞發(fā)育有顯著的影響,同樣的,我們發(fā)現(xiàn)Smad4基因條件性缺失對(duì)Th1/Th2/Th17細(xì)胞的分化也沒有顯著性的影響。
　　3)Smad4條件性缺失對(duì)T細(xì)胞增殖的影響
　　Smad4條件性缺失對(duì)幼年小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)目沒有影響,對(duì)年老小鼠脾細(xì)胞總數(shù)和CD4+T細(xì)胞數(shù)目也沒有影響,而我們發(fā)現(xiàn)Smad4Cre/Co/Co與Smad4Co/Co相比

15、CD8+T細(xì)胞數(shù)卻有著顯著性的差別,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因尚不明確。
　　4)Smad4條件性缺失對(duì)T細(xì)胞活化的影響
　　對(duì)新生小鼠脾細(xì)胞和年老(52周齡)小鼠的脾、淋巴結(jié)細(xì)胞的分析,我們發(fā)現(xiàn)Smad4Co/Co與Smad4Cre/Co/Co相比CD4+CD44hi細(xì)胞比例均沒有顯著性差異。而在對(duì)年老小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細(xì)胞中CD8+CD44hi細(xì)胞低于對(duì)照組小鼠,說明Smad4條件性缺失

16、對(duì)CD8+T細(xì)胞的活化有一定影響。
　　5)Smad4條件性缺失對(duì)胃腸道上皮穩(wěn)態(tài)的影響
　　曾有研究發(fā)現(xiàn),用Lck-Cre的方法T細(xì)胞條件性敲除Smad4基因小鼠在年老時(shí)會(huì)出現(xiàn)胃腸道多發(fā)性的腫瘤;而另有研究表明,以Lck-Cre或CD4-Cre技術(shù)T細(xì)胞特異性Smad4條件性敲除小鼠在年老時(shí)只會(huì)在十二指腸部位出現(xiàn)上皮細(xì)胞性腫瘤。在我們的研究中,對(duì)52周齡的Smad4條件性敲除小鼠肝、十二指腸和結(jié)腸病理切片,HE染色分析,并未

17、發(fā)現(xiàn)有胃腸道腫瘤的發(fā)生。我們推測,Smad4基因T細(xì)胞條件性缺失不一定會(huì)造成胃腸道的腫瘤,Smad4基因T細(xì)胞條件性缺失造成胃腸道的腫瘤的發(fā)生與否可能與基因型及飼養(yǎng)環(huán)境有著密切的關(guān)系。
　　6)Smad4條件性缺失對(duì)CD8+效應(yīng)CTL的影響
　　我們使用李斯特菌感染小鼠模型誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答,探討Smad4基因T細(xì)胞條件性敲除對(duì)CD8+T細(xì)胞活化的影響。在研究過程中我們發(fā)現(xiàn),Smad4基因條件性缺失會(huì)導(dǎo)致C

18、D8+效應(yīng)CTL細(xì)胞活化明顯滯后,李斯特菌尾靜脈注射5天時(shí)Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細(xì)胞中CD8+CD44hi細(xì)胞低于對(duì)照組小鼠,而在7天時(shí)這種顯著性差異消失。我們在研究中,發(fā)現(xiàn)李斯特菌感染Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞的GranB、IFN-γ等殺傷Marker水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組小鼠,同時(shí)Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細(xì)胞中短期效應(yīng)細(xì)胞CD127(low)/KLRG1(hi)CD8+T細(xì)胞的比例也低

19、于對(duì)照組小鼠,說明Smad4基因條件性缺失對(duì)CD8+效應(yīng)CTL細(xì)胞的殺傷功能有一定的影響。
　　7)Smad4條件性缺失小鼠影響CD8+CTL活化和殺傷效應(yīng)的機(jī)制
　　我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Smad4基因的T細(xì)胞條件性缺失對(duì)抗原特異性CD8+T細(xì)胞表面的IL-2Rα鏈、β鏈、γ鏈以及IL-15Rα鏈表達(dá)并沒有顯著的影響,因此,李斯特菌誘導(dǎo)的Smad4基因T細(xì)胞條件性敲除小鼠(Smad4Cre/Co/Co)脾細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞活

20、化滯后并不是由于其細(xì)胞表面IL-2R及IL-15R的異常表達(dá)所造成的。研究中發(fā)現(xiàn)Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細(xì)胞中CD43+CD27+細(xì)胞的比例明顯低于對(duì)照組小鼠,而CD43+CD27+細(xì)胞對(duì)CD8+效應(yīng)CTL活化和功能維持有重要的作用,我們推測這是造成其CD8+CTL活化滯后和殺傷效應(yīng)缺陷的原因之一。在體外實(shí)驗(yàn)中,我們用體外增殖分化實(shí)驗(yàn)排除了Smad4條件性缺失造成的抗原特異性CD8+T細(xì)胞之間的差別是由于CD8+T細(xì)胞內(nèi)在的缺

21、陷的影響。而接下來的實(shí)驗(yàn)顯示,Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞表面的CD40L表達(dá)低于對(duì)照組小鼠,CD40與CD40L的相互作用能夠誘導(dǎo)CD80/CD86共刺激信號(hào)的表達(dá),繼而活化pre-CTL。因此,我們認(rèn)為Smad4Cre/Co/Co小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞表面的CD40L低表達(dá)是造成CD8+CTL活化滯后的另外一個(gè)原因。
　　4.本文創(chuàng)新點(diǎn)
　　關(guān)于Smad4對(duì)CTL細(xì)胞分化有何影響的研究目前還