牛精子發(fā)生相關(guān)新基因家族-DAZ基因家族的克隆、序列分析與功能研究.pdf

1、犏牛是牦牛和黃牛遠(yuǎn)緣雜交的后代，乳、肉等生產(chǎn)性能顯著優(yōu)于其父母本，然而F1～F2代生精紊亂導(dǎo)致的雄性不育是困擾牦牛雜交改良和育種的難題。國(guó)內(nèi)外學(xué)者從組織形態(tài)學(xué)、生殖內(nèi)分泌學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和蛋白多肽等不同方面進(jìn)行了大量研究，但尚未取得具說服力的、能證實(shí)的理論依據(jù)，特別是分子生物學(xué)水平上的研究還未見報(bào)道。
　　 DAZ基因家族包括DAZ（Deleted in Azoospermia）、DAZL（DAZ-like）和BOULE基因，是精

2、子生成的重要調(diào)控因子。BOULE位于人類的3號(hào)染色體上，是DAZ基因家族的祖先基因（ancESTral gene），在動(dòng)物界的睪丸中表達(dá)（蠕蟲除外），調(diào)控精子的正常發(fā)生；DAZL起源于BOULE基因，位于人類2號(hào)染色體，在脊椎動(dòng)物亞門的生殖細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，迄今研究表明其功能至少是精子生成的重要調(diào)控因子；DAZ基因是DAZL的多拷貝基因，定位于Y染色體上，在人類和舊世界猴中的睪丸中表達(dá)，其缺失將導(dǎo)致精子生成停滯。本研究采用電子克隆

3、和克隆測(cè)序的方法在世界上首次獲得了牛亞科的DAZ基因家族，分別命名為b-DAZL和b-BOULE。B-DAZL（Genbank（登陸號(hào)：EF501823）長(zhǎng)2509bp，開放閱讀框?yàn)?95bp，編碼含295個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。采用電子定位的方法發(fā)現(xiàn)b-DAZL定位在黃牛1號(hào)染色體上，具有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子，外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)的剪切方式與靈長(zhǎng)類DAZL基因外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)的剪切方式一致，其可譯框與其它脊椎動(dòng)物DAZL基因cDN

4、A可譯框的核苷酸相似率為90％～94％，核酸序列相似性搜索發(fā)現(xiàn)，EST數(shù)據(jù)庫(kù)中存在與之高度相似的其他種屬的EST序列，如人類（95％）、狗（96％）、小鼠（91％）、褐家鼠（90％）等，且可譯框外顯子的組成，長(zhǎng)度和位置也高度保守。B-DAZL蛋白質(zhì)序列同源性比較表明：b-DAZL，與脊椎動(dòng)物門其他生物的DAZL蛋白有53％～96％的一致率，與哺乳動(dòng)物及人類的一致率為90％～96％；結(jié)合結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，其與棉冠獠狨、普通狨、松鼠猴、獼

5、猴、倭黑猩猩、小鼠狐猴和小鼠等脊椎動(dòng)物的結(jié)構(gòu)域組成相一致，且蛋白序列長(zhǎng)度也是保守的。B-DAZL組織表達(dá)譜表明，其具組織表達(dá)特異性，僅在黃牛生殖細(xì)胞和犏牛卵巢中表達(dá)，在精子生成障礙的犏牛睪丸中檢測(cè)不到其表達(dá)信號(hào)，預(yù)示b-DAZL可能與牛亞科精子生成有關(guān)，而犏牛睪丸切片表現(xiàn)出的典型DAZL蛋白缺失表型進(jìn)一步支持了上述推論。B-BOULE基因的cDNA序列長(zhǎng)941bp，編碼具293個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。電子染色體定位顯示b-BOULE定位在黃牛

6、2號(hào)上，具有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)的剪拼方式與靈長(zhǎng)類BOULE基因外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)的剪拼方式一致，其可譯框與其他脊椎動(dòng)物BOULE基因cDNA可譯框的核苷酸相似率為93％～97％，核酸序列相似性搜索發(fā)現(xiàn)，EST數(shù)據(jù)庫(kù)中存在與之高度相似的其他種屬的EST序列，如人類（95％）、獼猴（93％）、小鼠（88％）、褐家鼠（76％）等，且其可譯框外顯子的組成，長(zhǎng)度和位置也高度保守。B-BOULE蛋白質(zhì)序列同源性比較表明

7、：b-BOULE與脊椎動(dòng)物門其他生物的BOULE有77％～96％的一致率，與哺乳動(dòng)物及人類的一致率為93％～96％，并結(jié)合人類、棉冠獠狨、普通狨、松鼠猴、黑猩猩、小鼠狐猴對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，它們的結(jié)構(gòu)域組成相一致。對(duì)b-BOULE進(jìn)行了組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其僅在黃牛生殖細(xì)胞和犏牛卵巢中表達(dá)，在精子生成障礙的犏牛睪丸中檢測(cè)不到其表達(dá)信號(hào)，預(yù)示b-BOULE可能與牛亞科精子生成有關(guān)，而犏牛睪丸切片發(fā)現(xiàn)b-BOULE蛋白缺失的犏牛睪丸具有典