茶樹SSR分子標記技術體系的建立與應用.pdf

1、茶樹是我國重要的經濟作物之一，栽培歷史悠久、分布廣泛，種質資源極為豐富，但與其他重要經濟作物相比，目前對茶樹遺傳基礎的研究相對缺乏，在此方面的知識積累相對薄弱，尤其是對SSR標記技術的應用更是鮮見報道。本研究利用現(xiàn)有生物數(shù)據庫中的茶樹EST資源，開發(fā)SSR引物，并建立SSR標記技術體系，然后應用于茶樹品種資源的遺傳多樣性分析。其主要結果如下： 采用改進的DNA提取方法提取高質量的茶樹基因組DNA，用已知濃度的lambda DNA

2、 standard對所提DNA進行定量檢測，建立了一種新的測定茶樹基因組DNA濃度的方法。該法在國內發(fā)表的文獻中還未見采用。 通過對茶樹SSR反應體系各因素進行優(yōu)化，建立最適的反應條件為：反應總體積20 μL，各成分的濃度或含量分別為1×Buffer，MgCl<,2>1.5～2.5 mmol/L，dNTPs0.2mmol/L、引物各0.25 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U，DNA模板用量30 ng。PCR擴增程序為

3、95℃ 5 min；95℃ 1min，各引物最佳溫度退火45 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃ 10min。經多次擴增實踐證明，該技術體系的重復性和穩(wěn)定性良好。 利用公共數(shù)據庫(NCBI)中的茶樹ESI序列，采用Primer3軟件設計了33對SSR引物，并利用外文文獻中發(fā)表的17對引物，共合成50對SSR引物對茶樹基因組DNA進行擴增，有37對引物獲得了擴增產物，其可擴增率為74％。用37對可擴增引物對43個茶樹品種(系

4、)擴增，經8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，其中有34對引物產生多態(tài)性，不同引物擴增帶數(shù)分布在1～11條之間，擴增片段大小介于150～350 bp。 從34對可擴增引物中選擇16對擴增43個茶樹品種(系)，首次采用毛細管電泳檢測其擴增產物，共獲得142個等位變異。應用DPS軟件，進行遺傳距離和相似性系數(shù)計算，43份材料遺傳距離的變化范圍在0.059～0.820之間，說明供試茶樹資源間的遺傳變異十分寬廣。根據UPGMA法構建聚類樹

5、狀圖，在平均遺傳距離水平上，可將43份材料劃分為7個類群，大部分具有相近系譜的品種(系)被聚在一起?？梢?，SSR分子標記技術能較好地揭示品種資源問的親緣關系。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠銀染技術和毛細管電泳檢測方法對供試茶樹品種(系)不同引物的擴增產物進行檢測，初步建立了43個供試材料在34個SSR位點的指紋，為構建我國茶樹種質的SSR基因型數(shù)據庫奠定了方法學基礎。 本文研究的開展，將加速茶樹EST資源的開發(fā)利用與SSR標記技術在茶