野牦牛精子超微結(jié)構(gòu)和精液蛋白組分的研究.pdf

1、為了提高野公牦牛的繁殖性能,填補(bǔ)野牦牛精子研究領(lǐng)域的部分空白,本文進(jìn)行了以下幾個方面的研究.運(yùn)用電鏡技術(shù),詳細(xì)描述了野牦牛精子不同狀態(tài)下的超微結(jié)構(gòu),包括新鮮精液和冷凍精液中正常精子、畸形精子、獲能前后精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)及變化特征;測定了野牦牛精子透明質(zhì)酸酶(HYD)、頂體酶(ACE)、酸性磷酸酶(ACP)和乳酸脫氫酶(U)H)等酶活性;首次利用雙向電泳(2-DE)技術(shù)對野牦牛精液的蛋白組分進(jìn)行了初步分析,并建立了800多個點的野牦牛精子蛋白

2、質(zhì)圖譜.研究的結(jié)果及結(jié)論如下: 1.不同狀態(tài)下野牦牛精子的超微結(jié)構(gòu)通過電鏡觀測,野牦牛精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)符合牛屬動物精子特征,亦分頭、頸、尾三部分,全長為78.34±7.2μm;不育個體精子的超微結(jié)構(gòu)異常,并多為復(fù)合型;冷凍保存后,其頭部、頸部和尾部均受到不同程度的損傷,頭部損傷最為明顯,頂體、頂體內(nèi)容物出現(xiàn)分布不均、丟失等現(xiàn)象;獲能及頂體反應(yīng)(AR)時精子形態(tài)結(jié)構(gòu)變化呈連續(xù)性、囊泡化的特征,頂體外膜外突形成大囊泡,內(nèi)膜同時膨脹,頂

3、體外膜外突打褶形成串珠狀囊泡.上述研究結(jié)果表明:精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能是統(tǒng)一的,只有具備完整的形態(tài)結(jié)構(gòu),才有正常的受精能力. 2.野牦牛精子HYD、ACE、ACP和LDH等酶活性的測定冷凍后,野牦牛精子酶活性下降,并隨保存時間的延長,下降幅度增加;冷凍保存5年以上,下降幅度大于65﹪(P<0.05);該結(jié)果揭示,對凍精需抽樣測定功能和品質(zhì)后再用于生產(chǎn).不育個體精子HYD、ACE和ACP活性極顯著低于正常組(P<0.01),表明其精

4、子總體酶活性低弱,不僅死精多,而且活精中弱精比重大.野牦牛精子獲能前后的ACP活性無顯著差異,AR后ACP活性顯著高于獲能前,獲能以后HYD活性顯著提高(P<0.05);結(jié)果表明,HYD參與了精子獲能,ACP活性的檢測可以用于評價頂體反應(yīng). 3.野牦牛精液蛋白組分的2-DE實驗結(jié)果野牦牛精子全蛋白制備時,使用單層PercoU(70﹪)高速離心法去除圓細(xì)胞和精漿效果良好,用含7moI/L尿素、2mol/L 硫脲、4﹪CHAPS、1

5、﹪DTT和0.5﹪IPG Buffer的裂解液裂解野牦牛精子,輔之用漩渦混合器振蕩和液氮中反復(fù)凍融,裂解效果良好.野牦牛精子全蛋白2-DE,上樣量為30μg,上樣體積為32μl,銀染檢測,蛋白分離效果良好.初步建立800多個點的野牦牛精子蛋白質(zhì)圖譜,大量精子蛋白分布于Mw 20～60kDa、pI5～8之間,即中高分子量堿性蛋白居多:未能建立清晰的野牦牛精漿蛋自質(zhì)圖譜,但從2..DE圖上可以初步得出,其蛋白主要集中在Mw 10～120kD