核黃素受體蛋白對植物開花轉型和抗病防衛(wèi)調控作用的初步研究.pdf

1、核黃素在生物體內(nèi)以黃素單核苷酸FMN及黃素腺嘌呤二核苷酸FAD的形式作為黃素酶的輔酶，參與機體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應。核黃素參與植物抗氧化及過氧化過程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過敏反應過程中活性氧中間體(reactive oxygen intermediates，ROIs)的產(chǎn)生。ROIs是過敏細胞壞死的重要信號，能調節(jié)生長、抗病、抗蟲、抗逆，所以核黃素與植物免疫反應有關。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物體外施核黃素后，生長加快、作物產(chǎn)量提

2、高、抗逆能力增強，并且啟動未知的抗病信號通路而抗病增強。我們假設植物中內(nèi)源核黃素含量的變化可能影響相關生理生化過程，進而參與了植物的抗病防衛(wèi)和生長發(fā)育。我們以此為切入點，著手研究核黃素參與調控植物生長和防衛(wèi)的機制及與基本防衛(wèi)通路的交叉對話。 本實驗室已有整合中華鱉核黃素受體基因(riboflavin receptor protein，RIR)的轉基因擬南芥株系。已有研究結果表明轉基因擬南芥植株中導入外源的基因促使內(nèi)源核黃素總含量

3、的升高；與野生型相比，轉基因植株生長加快、個體較大、開花提前；丁香假單胞番茄致病變種Pseudomonas syringae pv．tomato DC3000在轉基因植株上發(fā)病癥狀減輕，細菌繁殖相對緩慢。針對轉基因植株出現(xiàn)的有益表型，我們展開系列研究，探討核黃素受體影響核黃素含量的機制及后續(xù)反應中相關基因的表達特征和基本通路的開啟交叉細節(jié)。 本文用PCR(polymerase chain reaction)的方法從含有軟體海龜編

4、碼核黃素結合蛋白(riboflavin receptor protein，RIR)基因的質粒中克隆出該基因，將RIR基因與原核表達載體pET30a(+)重組并進行表達，聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳表明蛋白質的大小35kD，以BL21(DE3)pLysS作宿主菌，1 mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)誘導4小時，融合蛋白His-taggeal RIR表達量達最大。體外RIR能與核黃素結合而淬

5、滅核黃素的自發(fā)熒光，表明RIR具有生物活性。本文研究結果可為今后研究核黃素受體蛋白調節(jié)核黃素含量參與植物生長發(fā)育調控的機制奠定基礎。 作為后續(xù)實驗基礎，研究了轉RIR基因株系RIRA18的遺傳背景。RIRA18作為父本，回交統(tǒng)計實驗F<,2>代以卡那抗性3：1分離，卡那抗性基因為顯性，符合孟德爾單基因位點控制的分離規(guī)律；同時反向PCR策略擴增T-DNA插入片段側翼序列，結果為單條帶，測序得到的序列經(jīng)比對為擬南芥第二染色體18S和

6、25S的一段間隔序列，即為轉基因單元的插入位點。這兩項結果表明RIRA18含單轉基因拷貝，且RIR的表型并非由插入點基因的破壞而產(chǎn)生。運用轉基因和人工授粉的方法將轉基因單元或RIR位點與基本通路的突變體etr1-1，ein2；aux1-7，jar1-1，abi1-1，npr1-1進行整合，在F<,1>、F<,2<代運用相應平板篩選及分子鑒定、表型輔助判斷等手段鑒定雜交品系單株，為研究核黃素參與調控植物防衛(wèi)和生長的交叉點提供基礎材料。

7、 為驗證轉基因植株開花提前，運用Real Time相對定量2<'-△△Ct>策略，比較Col-0和RIRA18從日出0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h各時間段光周期光受體基因PHYA、PHYB、CRY1、CRY2、中心振蕩器組分TOC、 CCS和下游的SOC、FT的節(jié)律表達情況。RIRA18中光受體基因和中心振蕩器組分表達都上調，效應基因SOC、FT的表達水平不如野生型，而與表型不符。本實驗結果為進一步的研究提供了