文心蘭離體培養(yǎng)優(yōu)化及轉(zhuǎn)化鐵氧還蛋白基因研究.pdf

1、文心蘭(Oncidium hybridum)為蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬植物，被插花界譽為切花“五美人”之一，具有較高的經(jīng)濟價值。文心蘭在栽培過程中極易感染病害，尤其是由歐文氏菌(Erwinia spp)引起的軟腐病(Soft rot)更是文心蘭產(chǎn)業(yè)的毀滅性病害，但至今卻仍無特別有效的防治方法，因此選育抗軟腐病的文心蘭品種是文心蘭育種的重要方向。鐵氧還蛋白（FD）作為一個大的基因家族在植物中普遍存在，現(xiàn)已證實Fd基因可幫助水

2、稻、煙草、擬南芥以及文心蘭在內(nèi)的許多植物獲得廣譜抗性。本研究以文心蘭‘小櫻桃’為材料，利用蘭花基因組數(shù)據(jù)，通過RT-PCR以及RACE技術(shù)克隆獲得2條文心蘭抗軟腐病相關(guān)的鐵氧還蛋白基因，并通過實時熒光定量PCR以及轉(zhuǎn)化文心蘭原球莖的研究，對這兩個基因進行初步的功能驗證。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.文心蘭離體培養(yǎng)優(yōu)化。以文心蘭‘小櫻桃’的PLBs為材料，研究不同添加量的香蕉泥對文心蘭PLBs增殖的影響，結(jié)果表明：以1/2MS+1

3、 g/L活性炭+50 g/L香蕉泥時增殖系數(shù)最高，高達5.41，且原球莖顏色鮮綠，長勢緊密均一沒有出現(xiàn)分化的情況；研究不同激素種類、激素濃度、自然添加物以及接種量對原球莖分化的影響，結(jié)果表明：1/2MS+50 g/L蘋果泥，接種量為8團/瓶分化效果最好，分化率達到100％。可見添加物對文心蘭‘小櫻桃’的PLBs的分化以及細胞的增殖有明顯的促進作用。
　　2.文心蘭OnFd與OnFNR基因的克隆與生物信息學分析。鐵氧還蛋白已被證實可

4、以幫助許多植物獲得廣譜抗性，本研究基于蘭花基因網(wǎng)站通過構(gòu)建進化樹，得到了7條與Fd基因親緣關(guān)系較近的基因序列，長度分別為244、505、452、616、933、209和270 bp，其中505、452、616以及933這四條基因含有完整的ORF序列。以文心蘭‘小櫻桃’健康與感染軟腐病的植株為材料，通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)其中有兩條基因在感染軟腐病植株中的相對表達量呈極顯著上升與下降。因此利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到這兩條基

5、因的全長序列，分別命名為OnFd（GenBank登錄號為KX461907）與OnFNR（GenBank登錄號為KX461908）。生物信息學分析表明：文心蘭OnFd含有一個典型的[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)域，而OnFNR卻包含有FAD結(jié)構(gòu)域和NADP+結(jié)構(gòu)域。這兩個基因具有相似的磷酸化位點和空間構(gòu)象等，但理化性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)差異明顯，推測這兩個基因的功能可能存在差異性。
　　3.文心蘭OnFd與OnFNR基因表達模式分析。以文心蘭‘小櫻桃

6、’健康植株為材料，利用實時熒光定量PCR檢測OnFd與OnFNR基因在文心蘭的根、假鱗莖、葉和花中均有表達。其中OnFd在花中的表達量最高，說明OnFd可能參與了植株的開花調(diào)控；而OnFNR在根中的表達量最低，而在葉中的表達量最高，其表達量約為根表達量的100倍，可見，OnFNR屬于光合型的LFNR。通過對文心蘭‘小櫻桃’健康植株進行不同激素和非生物脅迫處理，發(fā)現(xiàn)OnFd與OnFNR對IAA、ABA、GA、SA、NaCl以及PEG均有響

7、應(yīng)。在IAA、GA、SA、ABA以及NaCl的處理下OnFNR呈上調(diào)趨勢，只有在PEG的處理下呈下調(diào)趨勢；而OnFd在IAA、SA、ABA、NaCl的處理下呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，在GA和NaCl的處理下表達量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。無論是外源激素還是非生物脅迫均影響著OnFd與OnFNR的表達量，而這種影響可能與ROS的積累有著密切的關(guān)系。
　　4.文心蘭OnFd與OnFNR基因在不同感病階段的表達分析。以感染軟腐病文心蘭‘南茜’植株為材料，進行軟

8、腐病病菌分離，通過引物Y1/Y2得到一條與歐文氏桿菌(Erwinia carotovora)果膠酶基因(J03673.1)相似度高達99%的病原菌DNA序列，說明引起本試驗所用文心蘭發(fā)病的主要病原菌為歐文氏桿菌。用所得到的軟腐病病原菌對健康的文心蘭‘小櫻桃’進行侵染，并以感染軟腐病后1d、3d、6d、9d、12d以及健康植株的根、假鱗莖、下端葉和上端葉為材料，通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，文心蘭感病后各個部位的OnFd表達量均呈上升趨勢，尤其是

9、接種部位假鱗莖在接種病原菌1 d后表達量便表現(xiàn)出極顯著上調(diào)，并且在5個感病階段的表達量是健康植株的2.83~3.98倍。但OnFNR在接種病原菌后上端葉、下端葉以及接種部位假鱗莖的表達量均呈現(xiàn)下降趨勢，而根卻出現(xiàn)了上調(diào)趨勢，并在第12d達到最高值，其表達量約為對照組的4.5倍。因此無論是OnFd還是OnFNR對軟腐病菌均有顯著的響應(yīng)，說明這兩個基因可能在文心蘭響應(yīng)抗軟腐病過程中具有重要作用。
　　5.文心蘭OnFd與OnFNR蛋白

10、的亞細胞定位分析。在獲得OnFd與OnFNR的全長序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建融合綠色熒光1302-GFP蛋白的表達載體，并且通過農(nóng)桿菌介導法使其在煙草中異位表達，觀察蛋白的定位情況。結(jié)果表明：OnFd與OnFNR均定位于葉綠體。
　　6.文心蘭OnFd與OnFNR基因轉(zhuǎn)化文心蘭。構(gòu)建35S:OnFd與35S:OnFNR植物過表達載體；構(gòu)建以PJM007為中間載體的OnFd RNAi與OnFNR RNAi植物抑制表達載體，并利用農(nóng)桿菌介導法

11、將其轉(zhuǎn)入文心蘭原球莖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因PLBs在抗性培養(yǎng)階段生長狀態(tài)不好并且顏色偏黃，但進入分化培養(yǎng)后顏色開始變綠并且PLBs的體積較非轉(zhuǎn)基因的大。在過表達OnFd與OnFNR的PLBs中OnFd與OnFNR的表達量均呈顯著上升，在抑制OnFd表達的PLBs中OnFd與OnFNR的表達量均呈極顯著下降，但在抑制OnFNR表達的PLBs中OnFNR的表達量雖呈極顯著下降，而OnFd的表達量卻顯著提高。用軟腐病菌侵染經(jīng)過人為切傷的轉(zhuǎn)基因PLB

12、s發(fā)現(xiàn)，過表達OnFd與OnFNR的PLBs較抑制OnFd與OnFNR表達的PLBs抗軟腐病能力更強，這可能是因為在過表達OnFd與OnFNR的PLBs中OnFd與OnFNR的表達量均上升了。
　　SOD與鐵氧還蛋白之間有著密切的關(guān)系，因此本試驗通過以轉(zhuǎn)基因PLBs為材料，對SOD相關(guān)基因進行實時熒光定量發(fā)現(xiàn)，在過表達OnFd與OnFNR的PLBs中，Cu/ZnSOD以及FeSOD的表達量均出現(xiàn)顯著下調(diào)；當抑制OnFd與OnFNR