嗜水氣單胞菌J-1株OmpA蛋白原核表達(dá)、免疫原性分析及適于四膜蟲的OmpA表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是人和多種動(dòng)物的病原菌，其外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)具有良好的免疫原性。 1．根據(jù)已發(fā)表的嗜水氣單胞菌外膜蛋白A(OmpA)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR檢測(cè)18株嗜水氣單胞菌ompA分布情況，然后將J-1株、Y-65株&SPS-104株的ompA基因進(jìn)行克隆測(cè)序。PCR檢測(cè)結(jié)果表明15株擴(kuò)增出目的片段。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，34克隆的基

2、因片段均為948bp，編碼316個(gè)氨基酸。與NCBI上登錄的序列相比，同源性在93.1％-95％之間，缺失4個(gè)氨基酸。其中J-1株和SPS-104株的ompA基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為99.2％和98.1％，氨基酸缺失的位置一致；AhJ-1株和Y-65株ompA基因的核苷酸和氨基酸序列88.7％和89.6％，氨基酸缺失的位置相似。用DNA Star Protean進(jìn)行的抗原性和表面結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，與5株國(guó)內(nèi)外氣單胞菌參考株的抗

3、原性比較，抗原位點(diǎn)分布基本一致，說明OmpA蛋白很可能為氣單胞菌屬共有的保護(hù)性抗原。 2．將擴(kuò)增得到的去除信號(hào)肽序列J-1株的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段，定向克隆至表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)中，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切鑒定后測(cè)序。結(jié)果表明插入片段長(zhǎng)度為948bp，與NCBI上登錄的序列相比，同源性為93.1％～95％，缺失4個(gè)氨基酸。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ompA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)分子量約

4、57.4kD的蛋白，凝膠薄層掃描顯示OmpA在轉(zhuǎn)化菌中表達(dá)量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株總外膜蛋白的血清進(jìn)行Western blot，在57.4kD處有明顯反應(yīng)條帶。融合蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后免疫新西蘭兔制備抗血清，ELISA效價(jià)達(dá)1:12800以上。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，該血清與9株具有代表性的氣單胞菌的約35kOq外膜蛋白均有較強(qiáng)反應(yīng)，說明所表達(dá)的融合蛋白不僅保持原有外膜蛋白的免疫原性，而且提示O

5、mpA可能是嗜水氣單胞菌的共同保護(hù)性抗原。 3．為了能在一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下，既表達(dá)抗性篩選標(biāo)記，又能表達(dá)表位抗原OmpA蛋白，本試驗(yàn)自行設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，應(yīng)用重組PCR技術(shù)，先分別以pSK-H4-I-neo和嗜水氣單胞菌J-1株為模板，獲得抗性基因neo和外膜蛋白基因ompA，再通過重疊延伸的方法，將兩個(gè)基因通過一疏水性柔性多肽接頭(Gly<,4>Ser)<,3>堿基序列進(jìn)行前后拼接，構(gòu)建neo-GS-ompA融合基因。并以此融

6、合基因取代pSK-H4-I-neo質(zhì)粒中的neo基因，從而構(gòu)建一個(gè)擬在四膜蟲體內(nèi)表達(dá)外膜蛋白OmpA的表達(dá)質(zhì)粒pSK-H4-I-neo-GS-ompA。序列分析表明neo、ompA及l(fā)inker拼接組合的順序、方向及序列完全正確。質(zhì)粒的正確構(gòu)建為下一步轉(zhuǎn)化四膜蟲奠定基礎(chǔ)。 4．本試驗(yàn)首先摸索了四膜蟲最佳電擊時(shí)間，然后將適于四膜蟲的基因表達(dá)載體pSK-H4-I-neo-GS-ompA及其酶切后獲得的整個(gè)編碼區(qū)的線性插入片斷，在不同

7、的緩沖液、電壓及電容的組合下，電擊轉(zhuǎn)化到嗜熱四膜蟲接合株體內(nèi)進(jìn)行同源重組，以期在蟲體內(nèi)同時(shí)表達(dá)抗性基因neo和抗原基因ompA。結(jié)果：將四膜蟲BF-1和BF-5分別在37℃靜置饑餓22h時(shí)后混合，混合6h后開始接合，混合后7-8h接合對(duì)數(shù)達(dá)到高峰，此時(shí)為電擊轉(zhuǎn)化的最佳時(shí)間；接合期的蟲株比正常狀態(tài)的要小一些。pSK-H4-I-neo-GS-ompA及插入片斷電擊后均未獲得抗性蟲株，抗性基因neo未得到表達(dá)，可能是ompA基因中含有較多四膜