弓形蟲P30抗原單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：制備抗弓形蟲P30抗原的單克隆抗體，建立弓形蟲循環(huán)抗原檢測(cè)法，評(píng)價(jià)抗P30抗原單克隆抗體的早期診斷價(jià)值。 方法：重組質(zhì)粒pET28b(+)-P30經(jīng)BL21(DE3)表達(dá)，使用Ni-NTA親和層析柱純化重組P30蛋白, 經(jīng)透析、復(fù)性后，定量P30蛋白。以復(fù)性的P30蛋白免疫BALB/c小鼠，分離免疫小鼠的脾細(xì)胞，在聚乙二醇的作用下與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，融合后的細(xì)胞進(jìn)行HAT選擇培養(yǎng)，10~20天后篩選陽(yáng)性克隆。用重組

2、P30包板，間接酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽(yáng)性克隆經(jīng)亞克隆建株。降植烷預(yù)處理小鼠后，腹腔注射狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，體內(nèi)誘生腹水法制備抗體，7~10天后即可收獲腹水。對(duì)腹水中的McAb先用硫酸銨沉淀法進(jìn)行粗提，然后用免疫親和層析法進(jìn)一步純化?？焖俣ㄐ栽嚰埛y(cè)定其亞類, ELISA法測(cè)定腹水和純化后抗體的效價(jià)，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞核型分析、SDS-PAGE和Western blotting分析，ELISA法測(cè)定親和力。以純化McAb 2

3、H9包板，, 9D7為標(biāo)記抗體建立雙單抗夾心ELISA法，檢測(cè)感染鼠血清中的弓形蟲Cag。 結(jié)果：純化、復(fù)性后P30蛋白純度> 90％，濃度512 ng/mL。篩選出 2 株抗P30抗原的單克隆抗體，命名為9D7、2H9。用體內(nèi)誘生腹水法制備抗體，小鼠腹水陽(yáng)性形成率為 90％ 以上，腹水收獲量平均為 6.5 mL/只。9D7、2H9重鏈分別為IgG2a、IgG1，輕鏈均為κ型。9D7和2H9腹水平均效價(jià)分別在1∶8 000和1∶

4、10 000以上，純化后效價(jià)均在1∶3 000以上，純化后McAb蛋白含量在0.8～1.6 mg/mL。Western blotting分析顯示 2 株McAb均能識(shí)別弓形蟲速殖子天然P30抗原和重組P30抗原。細(xì)胞核型分析顯示，2 株雜交瘤細(xì)胞染色體均在100條以上。9D7和 2H9識(shí)別不同抗原表位，親和力常數(shù)分別為6.13×107 M-1和7.64×109M-1。雙單抗夾心ELISA檢測(cè)鼠血清中的Cag，第4、5、6天陽(yáng)性率分別為2