連續(xù)性血液凈化治療對(duì)MODS患者腸粘膜屏障功能障礙的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、腸道不僅是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)吸收器官而且也是有效阻擋腸腔內(nèi)各種有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素進(jìn)入血液循環(huán)的屏障。腸黏膜上皮組織正常結(jié)構(gòu)和功能的維持在防止腸道內(nèi)大分子毒素和細(xì)菌跨上皮細(xì)胞和細(xì)胞旁路進(jìn)入血液循環(huán)中起關(guān)鍵作用。腸黏膜上皮細(xì)胞間有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫緊密連接，由多種功能各異的蛋白質(zhì)包括Occludin和ZO-1等組成并包繞在上皮細(xì)胞的腔側(cè)端，受到細(xì)胞因子的高度調(diào)節(jié)并影響整個(gè)腸黏膜屏障的通透性。該結(jié)構(gòu)可有效地阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、毒素及炎性介質(zhì)等物質(zhì)的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)

2、運(yùn)，維持腸粘膜上皮屏障功能的完整，并對(duì)其所圍繞的細(xì)胞造成膜質(zhì)的區(qū)域性差異，使這些區(qū)域可進(jìn)行專一的功能活動(dòng)，如離子的定向轉(zhuǎn)運(yùn)等，其結(jié)構(gòu)破壞可導(dǎo)致腸黏膜通透性增高，使得腔內(nèi)大分子毒素穿過(guò)腸道正常保護(hù)層進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)在炎癥性腸病和感染性小腸炎中，緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白解聚和重組是其腸道屏障功能受損的主要病理改變。一些促炎介質(zhì)可下調(diào)Occludin和ZO-1的表達(dá)并使其發(fā)生重排。最近研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細(xì)胞內(nèi)iNOS和NO表達(dá)增加與腸道粘膜上皮細(xì)

3、胞受損及緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)下降有密切關(guān)系。在病理狀態(tài)下，NO主要是由iNOS大量合成。iNOS可被細(xì)菌或細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，在介導(dǎo)炎癥因子導(dǎo)致的腸上皮通透性增高中起了重要作用。
　　 CBP已成為危重患者的治療手段，尤其對(duì)多器官功能衰竭的搶救工作帶來(lái)了極大方便和成為有效的救治措施，在MODS的治療中CBP不僅作為一種血液濾過(guò)技術(shù)來(lái)清除炎癥介質(zhì)，而且在治療中發(fā)揮了強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，這是CVVH治療MO

4、DS新理念的一個(gè)重要依據(jù)。但是，CVVH是否通過(guò)改善腸黏膜屏障功能，減少細(xì)菌和毒素移位，減輕組織和器官損傷從而改善MODS的預(yù)后，目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。在本研究中，我們觀察CBP對(duì)腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白、iNOS的表達(dá)和P38MAPK活化的影響，探討CVVH改善MODS患者腸粘膜屏障功能障礙的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.收集了2007年12月至2009年5月從我院各科室病房轉(zhuǎn)到中心ICU治療的22例MODS患者作為研究對(duì)

5、象，根據(jù)患者的預(yù)后分為存活組和死亡組。以20例健康志愿者作為正常對(duì)照。MODS的診斷依據(jù)美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)/危重病醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)大會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)。所有病人在確診MODS之后的4小時(shí)之內(nèi)開始在常規(guī)綜合治療基礎(chǔ)上聯(lián)合連續(xù)性靜脈血液濾過(guò)（CVVH）治療，分別于CVVH前（0h），CVVH治療開始后6h，12h和20h時(shí)采集靜脈血，無(wú)菌塑料試管盛裝，在室溫下2000g離心10分鐘，分離血清，小量分裝后于-70℃貯藏待用，同時(shí)收集治療2hr時(shí)的置換廢液。以

6、血清二氨氧化酶（ADO）、D-乳酸和內(nèi)毒素水平以及腸黏膜上皮細(xì)胞的通透性作為評(píng)價(jià)腸黏膜屏障功能的指標(biāo)，以緊密連接蛋白分布和表達(dá)的變化作為腸黏膜破壞的標(biāo)志；動(dòng)態(tài)觀察CVVH治療前后患者血壓、心率、呼吸、APACHⅡ評(píng)分、血清二氨氧化酶（ADO）、D-乳酸和內(nèi)毒素水平的變化情況。
　　 2.分光光度法檢測(cè)血清二胺氧化酶和D-乳酸水平，鱟試劑偶氮基質(zhì)顯色法定量檢測(cè)血清內(nèi)毒素水平。
　　 3.用Caco-2細(xì)胞在體外建立單層腸粘

7、膜上皮模型，采用MODS患者CVVH治療前后各時(shí)間點(diǎn)無(wú)菌收集的血清和治療2hr時(shí)的置換廢液體外刺激培養(yǎng)，分別以健康正常人血清和置換液培養(yǎng)作為對(duì)照。Fluorescence reader檢測(cè)單層腸粘膜上皮細(xì)胞對(duì)熒光素標(biāo)記的葡聚糖4000（FD4）的通透量和millicell-ERS電阻儀檢測(cè)其跨膜電阻（TER）來(lái)評(píng)價(jià)腸粘膜上皮的通透性及CVVH對(duì)其影響。
　　 4.免疫熒光染色檢測(cè)上述各組刺激培養(yǎng)的Caco-2單層腸粘膜上皮細(xì)胞緊

8、密連接蛋白Occludin和ZO-1的分布和重排情況；Wes-tern blot檢測(cè)細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)水平的變化。
　　 5.Western blot檢測(cè)上述各組刺激培養(yǎng)的上皮細(xì)胞中磷酸化P38M--APK的蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 6.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)上述各組刺激培養(yǎng)的上皮細(xì)胞內(nèi)iNOS的基因表達(dá)水平的變化。
　　 7.用比色法檢測(cè)上述各組刺激培養(yǎng)的上皮細(xì)胞內(nèi)NO水平的變化

9、。
　　 結(jié)果：
　　 1.CBP治療過(guò)程中MODS患者臨床表現(xiàn)和全身狀況的變化：MODS患者在CVVH治療時(shí)血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，收縮壓，舒張壓和平均動(dòng)脈壓均無(wú)明顯波動(dòng)，心率在CVVH治療6小時(shí)后有所下降，此后一直穩(wěn)定至治療結(jié)束。12個(gè)患者在開始行CVVH治療時(shí)需要至少一種血管活性藥物維持正常血壓，其中有3個(gè)患者同時(shí)需要兩種藥物聯(lián)合，有2個(gè)患者同時(shí)需要三種藥物聯(lián)合。CVVH治療后，上述8位患者血管活性藥用藥劑量或數(shù)量減少，4

10、位患者血管活性藥物維持在治療前水平。15位合并代謝性酸中毒的患者在CBP治療12-20小時(shí)后得以糾正，10位患者的急性腎功能衰竭在CBP治療后也得以減輕。每個(gè)患者根據(jù)病情需要進(jìn)行1-5次CVVH治療，其中12例患者存活，10例患者死亡。MODS患者死亡組的APACHEⅡ評(píng)分顯著高于存活組，治療20小時(shí)后，兩組患者APACHEⅡ評(píng)分都較治療前下降，存活組下降程度顯著大于死亡組。
　　 2.MODS患者腸道屏障功能的變化及CBP對(duì)其

11、影響：與正常對(duì)照組相比，MODS患者存在明顯的腸黏膜屏障功能障礙，表現(xiàn)為MODS患者血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平以及MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞的通透性明顯增高。與MODS存活組相比，MODS死亡組外周血DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平及其血清刺激培養(yǎng)的腸粘膜上皮細(xì)胞的通透性增高更顯著。在CVVH治療過(guò)程中，與治療前相比存活組外周血內(nèi)毒素水平在6h明顯下降，死亡組在12小時(shí)下降，兩組患者外周血DAO水平在20小時(shí)明顯下降

12、；存活組患者下降幅度顯著高于死亡組。
　　 3.MODS患者血清誘導(dǎo)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞通透性的變化及CBP治療對(duì)其影響：與正常對(duì)照組相比，MODS存活組和死亡組患者治療前血清誘導(dǎo)的單層腸黏膜上皮細(xì)胞對(duì)FD4的通透性增高和跨上皮細(xì)胞TEER下降，CBP治療6h血清誘導(dǎo)的單層腸黏膜上皮細(xì)胞對(duì)FD4的通透性下降，并且TEER明顯增加，12h達(dá)最佳效果，20h時(shí)效果略有下降。尤其以存活組患者單層腸黏膜上皮細(xì)胞通透性改善更為顯著，顯著優(yōu)

13、于死亡組；與置換液對(duì)照組比較，置換廢液誘導(dǎo)的單層腸黏膜上皮細(xì)胞對(duì)FD4的通透性增高和TEER下降。
　　 4.MODS患者血清誘導(dǎo)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白重排及CBP對(duì)其影響：正常單層腸粘膜上皮細(xì)胞的Occludin和ZO-1主要分布在細(xì)胞周邊并在細(xì)胞與細(xì)胞接觸的部位形成連續(xù)光滑的緊密連接條帶，與細(xì)胞構(gòu)成蜂窩狀。與正常對(duì)照組相比，MODS患者血清培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞可見(jiàn)occludin和ZO-1分布發(fā)生改變，其染色減

14、弱，連續(xù)性中斷，部分?jǐn)嗔亚壹?xì)胞間連接松散，CVVH6h時(shí)機(jī)密連接蛋白重排減輕，細(xì)胞間緊密連接不規(guī)則和松散得以改善，尤以12小時(shí)最為明顯，并持續(xù)到20小時(shí)。
　　 5.MODS患者血清誘導(dǎo)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)變化及CBP對(duì)其影響：與正常對(duì)照組相比，CVVH治療前MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平下降，治療6小時(shí)后Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平升高，12小時(shí)后表

15、達(dá)水平升高接近正常水平，持續(xù)到治療20小時(shí)。
　　 6.MODS患者血清誘導(dǎo)的單層腸上皮細(xì)胞iNOSmRNA和NO表達(dá)水平的變化及CBP對(duì)其影響：與正常對(duì)照組相比，CVVH治療前MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞iNOS基因表達(dá)和NO生成水平明顯升高，在CVVH治療6小時(shí)后，單層腸黏膜上皮細(xì)胞iNOS基因表達(dá)和NO生成水平下降，治療12小時(shí)達(dá)最佳效果，20小時(shí)效果略有下降，但與治療6小時(shí)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

16、 7.MODS患者血清誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞P38 MAPK信號(hào)通路活化與iNOSmRNA表達(dá)的關(guān)系及其對(duì)TJs蛋白表達(dá)和分布的影響：與正常對(duì)照組相比，MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞P38MAPK活性明顯增高。P38MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580干預(yù)后，iNOSmRNA表達(dá)和NO生成水平明顯降低；同時(shí)Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平和組合也明顯改善。
　　 8.CVVH對(duì)P38MAPK信號(hào)通路的影響：與CV

17、VH治療前MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細(xì)胞相比，在CVVH治療6小時(shí)后的單層腸黏膜上皮細(xì)胞P38MAPK表達(dá)水平下降，治療12小時(shí)達(dá)最佳效果，20小時(shí)效果略有下降，但與治療6小時(shí)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.MODS患者存在腸粘膜屏障功能損害，其損害程度可能與患者的病情嚴(yán)重性和預(yù)后有相關(guān)。
　　 2.連續(xù)性血液凈化（CBP）治療不僅有效改善MODS患者的全身狀況如.APACHEⅡ評(píng)分，同

18、時(shí)也改善了患者腸粘膜屏障功能的損害。
　　 3.MODS患者腸粘膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1重排和表達(dá)下調(diào)參與了其腸粘膜屏障損害的過(guò)程，連續(xù)性血液凈化治療有效改善了Occludin和ZO-1連接蛋白的重排和表達(dá)。
　　 4.CBP治療對(duì)：MODS患者腸粘膜屏障的這種保護(hù)作用可能與其限制SIRS和氧化應(yīng)激進(jìn)而下調(diào)P38MAPK信號(hào)通路活性，抑制iNOSmRNA表達(dá)，減少NO生成有關(guān)，從而改善了MODS患