玉米DULL1和Shrunken1基因啟動子的克隆與功能分析.pdf

1、在植物基因工程中，人們最常用的是組成型啟動子啟動，該類啟動子能驅動外源基因在轉基因植物中高效的表達。但是，這樣會增加細胞內(nèi)物質和能量的負荷。所以我們采用組織特異性啟動子就能控制外源基因在特定的組織或器中表達。本課題通過生物信息學分析結果，克隆了DULL1和Shrunken1兩個基因的啟動子并通過農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉化對其表達特性進行了分析，同時通過篩檢法對DULL1基因啟動子進行了進一步的分析，確定其活性主要區(qū)域，獲得如下主要結果：<

2、br>　　1、通過PCR擴增分別獲得DULL1和Shrunken1基因啟動子，通過數(shù)據(jù)庫對這兩個基因啟動子序列分析，結果發(fā)現(xiàn)這兩個啟動子不僅含有基本的核心順式作用元件 TATA-box，而且 DULL1基因啟動子還具有決定其在胚乳中特異表達有關的順式調控元件，如GCN4_motif、Skn-1_motif，均為胚乳表達必須的順式調控元件。
　　2、將DULL1、Shrunken1基因啟動子與含有GUS報告基因的雙元表達載體pCAM

3、BIA1301連接，構成兩個新型表達載體，通過水稻遺傳轉化，分別得到13株和9株轉基因植株，經(jīng)過GUS組織化學染色表明，DULL1基因啟動子只在胚乳組織中表達，其他部位均不表達，說明 DULL1基因啟動子是一個胚乳特異性啟動子。Shrunken1基因啟動子在在根、莖、葉、葉鞘、穎殼中表達，在花和胚乳中不表達，說明該啟動子是個營養(yǎng)器官特異表達啟動子。
　　3、用5’端缺失法將DULL1基因啟動子全長缺失，得到四段不同長度的缺失片段，

4、并將其轉入水稻，得到陽性轉基因植株，經(jīng)過 GUS組織化學染色，缺失片段PDU1-3和PDU1-4只在胚乳中表達，說明這兩個缺失啟動子也是胚乳特異性啟動子，而PDU1-1和PDU1-2在任何組織中均無表達。根據(jù)GUS定量檢測，結果表明：DULL1基因啟動子全長的酶活性最高，PDU1-3和PDU1-4次之，PDU1-1和PDU1-2幾乎沒有酶活性，刪減實驗證明不同長度功能有差異，DULL1基因啟動子活性主要區(qū)域在-740~-8bp之間，以該