基于成熟合子胚外值體的水曲柳高頻體胚發(fā)生研究.pdf

1、水曲柳(Fraxinus mandshurica)屬木犀科白蠟樹屬，是我國東北地區(qū)重要的珍貴闊葉樹種。本研究以水曲柳成熟合子胚為外植體對水曲柳體細(xì)胞胚發(fā)生體系及植株再生技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，建立了高頻體細(xì)胞胚發(fā)生體系。通過進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的形態(tài)學(xué)觀察和生物化學(xué)檢測，來探討水曲柳體胚發(fā)生中外植體細(xì)胞的死亡是否是細(xì)胞程序化死亡，為后續(xù)水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生化機(jī)制和分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。具體結(jié)論如下:
　　(1)最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為M

2、S1/2（MS所有成分均減半），添加5 mg·L-1NAA與2mg·L-16-BA的植物激素配比，400 mg·L-1酸水解酪蛋白(CH)，蔗糖濃度75 g·L-1，瓊脂濃度6.5 g·L-1，pH為5.8。體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率67.5％，主要為直接發(fā)生，發(fā)生部位大多在子葉表面和邊緣;其中，約81.5％的體細(xì)胞胚在外植體褐化部位發(fā)生。
　　(2)子葉胚在添加10 mM ABA的成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)17 d后達(dá)到形態(tài)生理成熟，最高體細(xì)胞胚成熟

3、率可達(dá)90.0％。最佳的次生體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS1/2，添加0.05mg·L-1NAA，400 mg·L-1酸水解酪蛋白CH，加入25 g·L-1蔗糖與6.5 g·L-1瓊脂，體細(xì)胞胚增殖率93.3％。萌發(fā)培養(yǎng)基為1/3MS培養(yǎng)基，添加0.2 mg·L-16-BA、20 g·L-1蔗糖、200 mg·L-1酸水解酪蛋白CH和6.5 g·L-1瓊脂。培養(yǎng)30 d后體細(xì)胞胚萌發(fā)率為92.0％，生根率為27.1％;生根培養(yǎng)基為1/3MS，

4、添加0.01mg·L-1NAA，94.4％轉(zhuǎn)化為再生植株。將體培苗轉(zhuǎn)入已滅菌的，草炭土、蛭石、珍珠巖比例為5∶3∶2，用MS（無糖和激素）營養(yǎng)液混勻的基質(zhì)中，最終移栽成活率為85％。
　　(3)形態(tài)學(xué)觀察和組織學(xué)分析結(jié)果，由成熟合子胚子葉部分誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚，直接起源于表皮細(xì)胞，為單細(xì)胞起源。體細(xì)胞胚的發(fā)生過程與合子胚的發(fā)生過程類似，成熟的子葉形體胚具有明顯的“Y”字形維管組織，且已經(jīng)分化出子葉、胚軸、胚根;在球形胚、心形胚、魚雷

5、形胚及早期子葉形胚階段，存在類似胚柄的結(jié)構(gòu)，之后退化消失;已經(jīng)形成的體細(xì)胞胚與周圍細(xì)胞有明顯界限，且很容易與周圍組織分離。次生體細(xì)胞胚在原初體細(xì)胞胚的胚根端表面發(fā)生;也經(jīng)歷了由球形、心形、魚雷形、子葉形幾個(gè)階段，且不同步發(fā)生，有畸形子葉胚出現(xiàn)。
　　(4) TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測和DAPI細(xì)胞核染色結(jié)果顯示，13 d時(shí)細(xì)胞開始相繼發(fā)生PCD;17 d，19d期間，出現(xiàn)PCD高峰。
　　(5) H2O2含量在接種0d的時(shí)候