免疫增強(qiáng)劑T肽抗癌作用及機(jī)理研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞要想在機(jī)體存活必須能夠逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和免疫細(xì)胞的清除。待腫瘤細(xì)胞存活并生長(zhǎng)到一定的數(shù)目時(shí)會(huì)在局部形成組織塊,那么腫瘤塊內(nèi)的微環(huán)境為其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程提供的“保護(hù)傘”,使得微環(huán)境外的免疫細(xì)胞無法突破這個(gè)“深度免疫抑制的黑洞區(qū)”攻擊癌細(xì)胞,這個(gè)時(shí)候使用免疫藥物治療癌癥往往事倍功半。而手術(shù)治療癌癥一方面切除大部分瘤組織,減輕腫瘤負(fù)荷,另一方面機(jī)械地快速地破壞已經(jīng)形成“免疫抑制黑洞”的腫瘤微環(huán)境,可使殘?jiān)顑?nèi)部的腫瘤細(xì)胞、免疫抑

2、制細(xì)胞暴露,這樣微環(huán)境外活化的免疫細(xì)胞才有機(jī)會(huì)直接接觸腫瘤細(xì)胞,產(chǎn)生吞噬、細(xì)胞毒作用?；诖嗽聿⒔Y(jié)合臨床實(shí)體癌治療原則,我們成功建立了一種新型的腫瘤藥效學(xué)研究模型---小鼠術(shù)后殘瘤模型來評(píng)價(jià)和篩選抗腫瘤生物反應(yīng)調(diào)節(jié)藥物,并在此模型上篩選到一個(gè)很有潛力的抗腫瘤生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑T肽。
　　T肽是以天然四肽Tuftsin為母體進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得的一種新衍生物,它不僅保留了Tuftsin的促吞噬和抗腫瘤的生物活性,而且大大提高了抗酶解能力,

3、延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期。對(duì)T肽抗癌作用的藥效學(xué)研究中,我們采用了三種腫瘤小鼠模型評(píng)價(jià)藥效。T肽對(duì)傳統(tǒng)的皮下移植瘤小鼠模型的抑瘤率約在40％左右,而在手術(shù)荷瘤小鼠模型上T肽對(duì)術(shù)后殘瘤生長(zhǎng)的抑制效果顯著,抑制率達(dá)到48.9%-84.3%,并且未觀察到毒副作用,小鼠生存期較細(xì)胞毒性藥物環(huán)磷酰胺明顯延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室隨后建立了細(xì)胞免疫缺陷裸鼠手術(shù)單瘤模型和聯(lián)合免疫缺陷的SCID鼠手術(shù)單瘤模型,T肽對(duì)多種皮下移植瘤殘瘤都有良好的抑制作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模

4、型中,T肽延緩惡性腫瘤細(xì)胞的血液轉(zhuǎn)移發(fā)生,減輕侵襲腫瘤的嚴(yán)重程度。
　　結(jié)合T肽的藥物結(jié)構(gòu)特性和細(xì)胞生物學(xué)功能,采用RT-PCR、Realtime-PCR、免疫組化、ELISA、westernblot等檢測(cè)手段開展抗癌作用機(jī)理的研究。巨噬細(xì)胞是T肽的特異靶細(xì)胞之一。體外,T肽能夠提高巨噬細(xì)胞的增殖能力。通過流式檢測(cè)Ana-1細(xì)胞的周期,進(jìn)一步確證T肽能夠促進(jìn)Ana-1巨噬細(xì)胞的增殖,調(diào)節(jié)其G1期向S期的進(jìn)程。細(xì)胞周期中G1/S期的

5、調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)經(jīng)過傳遞,整合匯集到細(xì)胞核,對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)。調(diào)控細(xì)胞周期的眾多重要蛋白中,P21WAF1是G1/S期轉(zhuǎn)移的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。Westernblot的結(jié)果表明隨著T肽給藥的時(shí)間延長(zhǎng)和給藥劑量的增加,P21WAF1的蛋白量明顯下調(diào),其作用底物蛋白CDK2的磷酸化水平相應(yīng)增加。T肽影響巨噬細(xì)胞增殖的活性與其激活ERK/JNK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。
　　另一方面,T肽能夠結(jié)合巨噬細(xì)胞表面特異性抗體,

6、在短時(shí)間內(nèi)激活NF-κB信號(hào)通路,活化巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞被活化后其吞噬功能、細(xì)胞毒功能明顯增強(qiáng),同時(shí)介導(dǎo)M1表型極化,分泌Th1促炎性因子TNF-α、IL-12、NO、IFNα/β以及趨化因子CXCL9、CXCL11等等。在體外用IL-4誘導(dǎo)M2極化的Ana-1巨噬細(xì)胞模型中,T肽同樣能夠促使M2巨噬細(xì)胞中Th1細(xì)胞因子的表達(dá)增加,隨著T肽給藥濃度的增加,M2巨噬細(xì)胞代表基因Arg-1mRNA明顯下調(diào),M1巨噬細(xì)胞代表基因iNOS、IL

7、-12轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)上調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示T肽能夠逆轉(zhuǎn)M2巨噬細(xì)胞的表型。腫瘤微環(huán)境中占主導(dǎo)地位的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM大多數(shù)為M2巨噬細(xì)胞。從T肽治療的小鼠術(shù)后殘瘤組織中原代分離出TAM,同樣方法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)T肽給藥組TAM和Tuftsin給藥組TAM與術(shù)后荷瘤組TAM相比,除了IL-1β,其它Th1和Th2細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄能力被顯著抑制。NF-κB通路介導(dǎo)T肽對(duì)靜止期巨噬細(xì)胞的M1表型極化,而TAM細(xì)胞為一群特殊的NF-κB信號(hào)

8、通路缺陷的巨噬細(xì)胞,T肽很有可能不能通過此通路激活TAM,從而逆轉(zhuǎn)TAM的功能和表型。TAM中的Th2細(xì)胞因子表達(dá)同樣被抑制,說明T肽還是能夠通過其它途徑影響TAM的炎癥因子表達(dá)。
　　2006年Tuftsin受體NRP-1的發(fā)現(xiàn)和五肽TKPRR在VEGF165/VEGFR2/NRP-1中的作用,提示Tuftsin可以與VEGF165競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NRP-1,阻斷VEGF165與VEGFR2結(jié)合,抑制腫瘤血管生成。作為Tuftsin的聚

9、合類似物,T肽減少M(fèi)CF-7裸鼠術(shù)后殘瘤組織和M2巨噬細(xì)胞中VEGF和MMP-9兩種因子的蛋白合成,抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。對(duì)NRP-1受體,T肽顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞中NRP-1的表達(dá),對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的NRP-1表達(dá)沒有影響。NRP-1的表達(dá)增加可能與T肽促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖和活化能力密切相關(guān),也可能參與了T肽間接抑制腫瘤的生長(zhǎng)過程。
　　本研究還初步探討了T肽對(duì)PD-1/PD-L1信號(hào)通路的影響。在腫瘤微環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞與其間質(zhì)中的抗原

10、遞呈細(xì)胞可以通過負(fù)性協(xié)同共刺激分子PD-L1和PD-1分子相互作用誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,抑制CD4和CD8T細(xì)胞的增殖和活化,最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生。體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)T肽對(duì)腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的多種B7家族共刺激因子的表達(dá)產(chǎn)生影響,例如4-1BB、PD-L2和OX40分子的表達(dá)上調(diào),PD-L1/PD-1分子下調(diào),提示T肽可以阻滯PD-1/PD-L1程序性死亡通路,從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化,調(diào)控機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視能力。