小分子多肽抗實驗性肝癌及其機制的初步研究.pdf

1、[目的]觀察小分子多肽CMS024-02抗肝癌的作用，并從細胞、亞細胞及分子水平探討其可能的作用機制。 [方法]應用人肝細胞癌BEL-7402裸鼠移植瘤模型，動態(tài)觀察CMS024-02(320，160，80μg/kg/d)對BEL-7402肝細胞癌腫瘤體積、瘤重的作用，對實驗動物一般狀態(tài)的影響，以及通過血涂片，骨髓涂片觀察藥物的毒副作用。 以BrdU法、MTT法及LDH法，觀察藥物作用不同時間后CMS024-02對腫瘤細

2、胞分裂增殖、細胞代謝活力的影響及細胞毒作用。以β-半乳糖苷酶染色法，觀察CMS024-02誘導腫瘤細胞衰老的作用。以瓊脂糖凝膠電泳觀察藥物對體外培養(yǎng)BEL-7402細胞DNA片段化的影響。 采用免疫組化方法，觀察藥物作用后裸鼠移植瘤組織中細胞增殖核抗原(PCNA)表達情況；以原位末端標記(TUNEL)法觀察CMS024-02對裸鼠移植瘤細胞的促凋亡作用；以病理HE染色、透射電鏡的方法觀察CMS024-02誘導BEL-7402裸鼠

3、移植瘤細胞發(fā)生凋亡和壞死的作用。 采用原子力顯微鏡觀察CMS024-02對體外培養(yǎng)BEL-7402細胞DNA結構的影響；使用美國Affymetrix公司生產的人類基因組寡核苷酸芯片，觀察CMS024-02對BEL-7402肝細胞癌基因表達譜的影響。 應用RT-PCR、WesternBlot、免疫組化、ELISA等方法，觀察CMS024-02對人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤PTEN、Akt、MDM2、NF-κB，COX-2

4、、p21、p27、p53基因、蛋白表達水平及相應的酶活性的影響。 [結果]與生理鹽水對照組相比，CMS024-02的給藥劑量為320、160μg/kg/d時，均能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，表現(xiàn)為腫瘤重量、體積減小(p＜0.05)，對腫瘤的抑制率可分別達57.60％及58.24％。同20mg/kg/d環(huán)磷酰胺陽性處理組相比，各CMS024-02處理組均能使裸鼠體重顯著性增加，且毛色、皮屑、活動狀態(tài)等其它生存狀態(tài)指標均優(yōu)于環(huán)磷酰胺組

5、。同時CMS024-02對裸鼠骨髓未見明顯抑制作用，對裸鼠外周血細胞數(shù)量、形態(tài)和比例也沒有明顯影響。 CMS024-02能夠抑制體外培養(yǎng)的BEL-7402細胞DNA合成，降低腫瘤細胞的代謝活力，并對其有細胞毒作用。還能夠誘導體外培養(yǎng)的BEL-7402細胞發(fā)生衰老，并可使細胞DNA發(fā)生片斷化。 CMS024-02作用后，可使BEL-7402裸鼠移植瘤細胞中PCNA表達量降低，同時TUNEL法發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中凋亡細胞增多。病理

6、HE染色、電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)CMS024-02可以誘導BEL-7402肝癌裸鼠移植瘤細胞發(fā)生凋亡和壞死。 原子力顯微鏡研究結果顯示：1μg/mLCMS024-02可能造成腫瘤細胞基因組DNA匯聚；基因芯片分析則發(fā)現(xiàn)，CMS024-02能夠影響B(tài)EL-7402多個腫瘤相關基因的表達水平。 應用RT-PCR、WesternBlot、免疫組化、ELISA、酶活性測定等方法發(fā)現(xiàn)，CMS024-02能改變抑癌基因－癌基因間的平衡關系，

7、造成抑癌基因PTEN、p21、p27mRNA與蛋白表達增加，但對p53沒有明顯影響；使癌基因Akt及COX-2mRNA與蛋白表達減少、MDM2mRNA表達減少且胞核中的蛋白表達下降；p-PTEN蛋白表達減少而p-Akt蛋白表達增加；PTEN磷酸酶活性增加、Akt激酶活性下降；在對NF-κBp50及p65亞單位mRNA表達無影響的狀況下，能顯著抑制其蛋白表達。 [結論]CMS024-02能顯著性抑制實驗性人肝癌BEL-7402裸鼠