塞來昔布抗胃癌作用機(jī)制及Fas、FasL在胃癌中表達(dá)意義的研究.pdf

1、胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居我國各類惡性腫瘤的首位。臨床早期胃癌大多無癥狀或癥狀不典型，早期診斷困難；臨床就診者大部分屬于中、晚期，失去手術(shù)機(jī)會或術(shù)后易復(fù)發(fā)。因此，提高胃癌患者生活質(zhì)量和無病生存期的化療顯得很重要。 選擇性COX-2抑制劑抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究，倍受腫瘤學(xué)專家們關(guān)注。國內(nèi)外多個研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布有抑制胃癌細(xì)胞增殖凋亡作用，對其作用的分子機(jī)理研究僅局限于對環(huán)氧化酶-2的活性抑制。一些研

2、究表明COX-2抑制劑通過抑制環(huán)氧化酶-2的活性，減少前列腺素E2的釋放，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對細(xì)胞周期調(diào)控具有重要意義的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p16和p21表達(dá)的影響，及對細(xì)胞Fas、FasL調(diào)亡途徑中Fas、FasL蛋白表達(dá)和凋亡相關(guān)調(diào)控因子Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，國內(nèi)外尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。探討選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對BGC-823胃癌細(xì)胞抑瘤作用，從細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)，F(xiàn)

3、as、FasL凋亡系統(tǒng)與凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控等層面，“立體”和系統(tǒng)地研究胃腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示選擇性COX-2抑制劑塞來昔布抑制BGC-823胃癌細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控機(jī)理，將為包括塞來昔布在內(nèi)的選擇性COX-2抑制劑抗胃癌等腫瘤的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，為發(fā)現(xiàn)新的分子靶標(biāo)提供新的思路。 第一章塞來昔布抑制BGC-823胃癌細(xì)胞增殖及對p16和p21表達(dá)的影響 目的：研究塞來昔布對體外培養(yǎng)的BGC-823胃癌細(xì)胞增

4、殖的影響及對細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p16和p21表達(dá)的影響。 方法：采用MTT比色法檢測塞來昔布對BGC-823胃癌細(xì)胞增殖的抑制；通過流式細(xì)胞儀技術(shù)研究不同濃度的塞來昔布對BGC-823胃癌細(xì)胞周期的影響；通過RT-PCR技術(shù)檢測塞來昔布對細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p16mRNA及p21mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：①塞來昔布濃度為20，40，60，80，100，120μmol/L，24hr時抑制率（％）分別

5、為：7.63±2.66，13.33±0.95，18.83±0.91，24.63±1.55，33.20±1.14，55.00±6.50；48hr時抑制率（％）分別為：10.72±3.20，25.16±2.70，37.22±1.60，42.42±2.41，46.79±4.57，91.64±4.14；72hr時抑制率（％）分別為：10.91±1.61，31.39±3.20，54.82±1.25，62.41±5.51，74.88±1.02，98

6、.17±0.69。塞來昔布各濃度組均抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的生長，并呈時間和濃度依賴性。②流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：塞來昔布濃度為0，20，40，60，80，100μmol/L時，G1期細(xì)胞數(shù)比例分別為0.603±0.016，0.643±0.006，0.671±0.005，0.708±0.008，0.750±0.007，0.787±0.006；S期細(xì)胞數(shù)比例分別為0.307±0.006，0.223±0.003，0.209±0.005，

7、0.193±0.015，0.157±0.005，0.122±0.006。塞來昔布隨濃度增加G1期細(xì)胞數(shù)比例逐漸增加，S期細(xì)胞數(shù)比例逐漸減少。各濃度組間細(xì)胞數(shù)比例兩兩比較，具有顯著性差異（P<0.05）。③RT-PCR結(jié)果顯示不同濃度塞來昔布作用于BGC-823胃癌細(xì)胞后，塞來昔布各濃度組p16mRNA和p21mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物均有表達(dá)。塞來昔布濃度為0，20，40，60，80，100μmol/L時，p16mRNA表達(dá)的相對豐度分別為：0.

8、223±0.006，0.296±0.012，0.381±0.008，0.438±0.017，0.494±0.002，0.663±0.068；p21mRNA表達(dá)的相對豐度分別為：0.435±0.045，0.642±0.098，0.730±0.014，0.813±0.069，0.907±0.058，1.030±0.051，p16mRNA和p21mRNA表達(dá)的相對豐度隨塞來昔布濃度增加而增加。各濃度組間相對豐度兩兩比較，具有顯著性差異（P<0

9、.05）。 結(jié)論：①塞來昔布抑制BGC-823胃癌細(xì)胞增殖，呈時間和濃度依賴性。②塞來昔布干預(yù)BGC-823胃癌細(xì)胞增殖，使G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)減少，阻滯胃癌細(xì)胞周期于G1期。③塞來昔布通過上調(diào)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21mRNA和p16mRNA表達(dá)，抑制BGC-823胃癌細(xì)胞周期進(jìn)展。 第二章塞來昔布誘導(dǎo)BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡及對Fas、FasL及Bcl-2表達(dá)的影響 目的：研究塞來昔布誘導(dǎo)

10、BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡及對凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL及Bcl-2表達(dá)的影響。 方法：通過流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察不同濃度的塞來昔布對BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡的影響；通過WesternBlotting技術(shù)檢測塞來昔布對凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL和Bcl-2表達(dá)的影響。 結(jié)果：①流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)：塞來昔布濃度在0，20，40，60，80，100μmol/L時，凋亡細(xì)胞比率（％）分別為：0.503±0.018，5.870

11、±0.325，11.396±0.267，17.567±0.376，24.439±0.326，52.933±2.575；隨塞來昔布濃度增加凋亡細(xì)胞比率增加。各濃度組間凋亡細(xì)胞比率兩兩比較，具有顯著性差異（P<0.05）。②WesternBlotting結(jié)果顯示：塞來昔布濃度為0，20，40，60，80，100μmol/L時，作用BGC-823胃癌細(xì)胞48h后，F(xiàn)as蛋白相對含量分別是0.1113±0.0037，0.1017±0.0065，

12、0.1975±0.0100，0.3297±0.0053，0.4595±0.0045，0.5204±0.0148；FasL蛋白相對含量分別是0.8070±0.0268，0.7311±0.0780，0.6254±0.0501，0.5465±0.0180，0.4378±0.0081，0.3760±0.0034；Bcl-2蛋白相對含量分別是0.5448±0.0049，0.5213±0.0326，0.4256±0.0421，0.3934±0.03

13、05，0.2659±0.0121，0.2294±0.0081。在0～100μmol/L濃度范圍內(nèi)Fas蛋白表達(dá)上調(diào)和FasL、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，均呈濃度依賴性。各濃度組間蛋白相對含量兩兩比較，具有顯著性差異（P<0.05）。 結(jié)論：①塞來昔布誘導(dǎo)BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡，在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。②塞來昔布在一定濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)as蛋白表達(dá)呈濃度依賴性上調(diào)，F(xiàn)asL、Bcl-2蛋白表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)。③塞來昔布誘導(dǎo)胃癌細(xì)

14、胞凋亡可能與Fas蛋白上調(diào)，F(xiàn)asL、Bcl-2蛋白下調(diào)有關(guān)。 第三章Fas、FasL在胃癌及局部淋巴結(jié)組織中表達(dá)意義 目的：探討胃癌及局部淋巴結(jié)組織中Fas、FasL蛋白的表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 方法：通過免疫組化方法研究64例胃癌及局部淋巴結(jié)組織和20例正常胃組織Fas和FasL蛋白的表達(dá)，并分析其與年齡、性別、病理亞型和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 結(jié)果：①正常胃組織Fas蛋白陽性表達(dá)率高，在胃

15、癌組織中Fas蛋白陽性表達(dá)率低；正常胃組織FasL蛋白陽性表達(dá)率低，在胃癌組織中FasL蛋白陽性表達(dá)率高。二者間陽性表達(dá)均有顯著性差異（P<0.001）。②Fas蛋白在有侵犯組淋巴結(jié)組織中陽性表達(dá)率高，在無侵犯組淋巴結(jié)組織中陽性表達(dá)率低，二者間陽性表達(dá)有顯著性差異（P=0.003）。FasL在兩組淋巴結(jié)組織中陽性表達(dá)無差異（P=0.593）。③Fas蛋白在高中分化組胃癌組織中陽性表達(dá)率高，在低分化組胃癌組織中陽性表達(dá)低，二組間陽性表達(dá)有

16、顯著性差異（P=0.015）。反之，F(xiàn)asL蛋白在高中分化組胃癌組織中陽性表達(dá)率低，在低分化組胃癌組織中陽性表達(dá)率高，二組間陽性表達(dá)有顯著性差異（P=0.021）。④胃癌組織中Fas、FasL蛋白陽性表達(dá)率與年齡、性別及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系。⑤胃癌組織中Fas和FasL兩者間陽性表達(dá)率，兩兩比較有顯著性差異（P<0.001）；兩者表達(dá)無直線相關(guān)性（rs=-0.425，P=0.575）。 結(jié)論：①胃癌組織中Fas蛋白表達(dá)下調(diào)