London-Swedish APP雙突變轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立和初步表型分析.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'S disease，AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶減退和認(rèn)知障礙。AD的主要神經(jīng)病理學(xué)特征為過度的細(xì)胞外13淀粉樣蛋白(amyloidβprotein，Aβ)沉淀、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)增多、Tau蛋白的過度磷酸化、突觸密度減少、神經(jīng)元細(xì)胞減少等。為了更加深入的探究AD的發(fā)病機(jī)制，研究人員建立了一系列的動物模型作為研究工具。淀粉樣蛋白前體蛋白(The amyloid

2、 precursor protein，APP)在 AD發(fā)病機(jī)制中起重要作用，APP經(jīng)過剪切加工后的Aβ是AD患者腦內(nèi)老年斑的主要成分，而點突變的APP則是早發(fā)性AD(early onset of familialAlzheimer's disease，F(xiàn)AD)的主要病因。目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種APP突變型轉(zhuǎn)基因小鼠模型如PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠模型，APP23轉(zhuǎn)基因小鼠模型等，但是大多數(shù)模型出現(xiàn)病理及行為學(xué)改變的時間比較滯后，通常在六月齡

3、以后才出現(xiàn)上述改變。因此我們建立了London/Swedish APP雙突變轉(zhuǎn)基因小鼠，使小鼠能夠比其它APP轉(zhuǎn)基因動物更早的出現(xiàn)病癥，提高使用模型進(jìn)行研究時工作效率。本研究主要包括以下三個部分的實驗內(nèi)容： 　　1.London/Swedish hAPP雙突變轉(zhuǎn)基因載體及小鼠的制備：將London/Swedish APP雙突變基因插入到PDGF啟動子下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，通過顯微注射法建立APP695V652I/K596N/

4、M597L轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠。 　　2.分子生物學(xué)水平及病理學(xué)分析：采用PCR技術(shù)鑒定APP695V652I/K596N/M597L轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表型，鑒定出四只Founder鼠。進(jìn)一步用RT-PCR和Western blotting檢測hAPP695V652I/K596N/M597L基因的表達(dá)，篩選并建立了2高表達(dá)的系A(chǔ)PP695V652I/K596N/M597L轉(zhuǎn)基因小鼠。免疫組織化學(xué)顯示在海馬區(qū)雙突變APP695

5、V652I/K596N/M597L轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)的陽性細(xì)胞數(shù)目較單突變APP695V652I轉(zhuǎn)基因小鼠及野生小鼠明顯增多。常規(guī)的病理學(xué)檢查轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織未發(fā)現(xiàn)異常。 3.行為學(xué)檢測：采用水迷宮檢測系統(tǒng)對APP695V652I/K596N/M597L轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)改變進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，三月齡時APP695V652I/K596N/M597L轉(zhuǎn)基因小鼠，單突變APP695V652I轉(zhuǎn)基因小鼠及野生小鼠在經(jīng)過Morris水迷宮隱

6、蔽平臺實驗時，APP695V652I/K596N/M597L轉(zhuǎn)基因小鼠尋找到隱蔽平臺的潛伏期比APP695V652I轉(zhuǎn)基因小鼠及野生小鼠明顯延長。探索試驗發(fā)現(xiàn)APPV652I/K596N/M597L轉(zhuǎn)基因小鼠比APPV652I轉(zhuǎn)基因小鼠及野生小鼠穿越目標(biāo)象限的次數(shù)明顯減少。 綜上所述,APP695V652I/K596N/M597L轉(zhuǎn)基因小鼠較APP695V652I轉(zhuǎn)基因小鼠更早的表達(dá)hAPP，出現(xiàn)學(xué)習(xí)認(rèn)知能力障礙的時間明顯提前，