鹽酸多奈哌齊對(duì)血管性癡呆小鼠海馬細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶表達(dá)變化的影響.pdf

1、目的：血管性癡呆(vascular dementia，VD)是因腦血管疾病所致的智能及認(rèn)知功能障礙臨床綜合征。隨著世界人口老齡化和疾病譜的變化以及對(duì)疾病診斷水平的不斷提高，VD的發(fā)病呈現(xiàn)明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，越來(lái)越嚴(yán)重地威脅著老年人的身心健康，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織已將此病列為21世紀(jì)的重點(diǎn)研究項(xiàng)目。目前，VD的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，因此，探討VD發(fā)病機(jī)制、在治療原發(fā)病的基礎(chǔ)上加用促智藥物有望更好改善VD患者的生存質(zhì)

2、量。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族中的重要成員，最初被認(rèn)為和細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化有關(guān)，最近研究表明，ERK信號(hào)通路與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系。眾所周知，血管性癡呆的重要表現(xiàn)之一是學(xué)習(xí)和記憶障礙，海馬是學(xué)習(xí)、記憶的重要結(jié)構(gòu)，那么，在VD小鼠的海馬組織中，ERK具有怎

3、樣的變化，目前尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本研究通過(guò)建立血管性癡呆動(dòng)物模型，觀察其海馬ERK1、ERK2及p-ERK(ERK的活性形式)的表達(dá)變化，以及觀察促智藥物中樞型膽堿酯酶抑制劑——鹽酸多奈哌齊(donepezil hydrochloride)對(duì)他們的影響，在揭示了VD發(fā)病機(jī)制的同時(shí)也為臨床用藥提供了理論基礎(chǔ)。 方法：本研究分為二部分。第一部分以昆明小鼠為研究對(duì)象，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈絲線結(jié)扎方法、經(jīng)連續(xù)三次反復(fù)缺血.再灌注，制備VD模型，并

4、設(shè)立假手術(shù)組、藥物組(鹽酸多奈哌齊組)；造模術(shù)后第29、30天，利用跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)裝置對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)測(cè)試，并觀察各組小鼠行為學(xué)差異。第二部分以4％多聚甲醛溶液固定的小鼠腦組織為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染色，運(yùn)用Image-Pro Plus圖象分析軟件對(duì)各組小鼠海馬組織CA1區(qū)相同面積內(nèi)ERK1和ERK2的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度；對(duì)各組小鼠海馬組織CA3區(qū)p-ERK的表達(dá)進(jìn)行平均光密

5、度測(cè)定，運(yùn)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行3組間的兩兩比較，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：(1)跳臺(tái)試驗(yàn)：模型組小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)顯著下降，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)、錯(cuò)誤次數(shù)增加(P<0.05)，記憶階段的潛伏時(shí)間縮短(P<0.05)、錯(cuò)誤次數(shù)增加（P<0.05)；藥物組較模型組學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)明顯改善(P<0.05)，并且與假手術(shù)組比較無(wú)顯著差別(P>0.05)

6、。(2)水迷宮試驗(yàn)：模型組小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)也顯著下降，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間延長(zhǎng)和錯(cuò)誤次數(shù)增加(P<0.05)，記憶階段的游全程時(shí)間延長(zhǎng)和錯(cuò)誤次數(shù)增加(P<0.05)；藥物組較模型組明顯改善(P<0.05)，并且與假手術(shù)組之間無(wú)顯著差別(P>0.05)。(3)海馬HE染色：假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較致密整齊，核大而圓，核仁明顯；相比之下，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列松散，層次不清，有細(xì)胞缺失現(xiàn)象，出現(xiàn)炎性細(xì)胞

7、浸潤(rùn)，胞體變小，核固縮，胞質(zhì)濃染；藥物組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，核固縮現(xiàn)象較少見(jiàn)。(4)海馬CA1區(qū)ERK1、ERK2的表達(dá)變化：在光鏡下，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)層次清楚，有大量陽(yáng)性神經(jīng)元，陽(yáng)性物質(zhì)主要位于胞膜及胞漿內(nèi)，細(xì)胞排列緊密，呈棕黃色，胞體較大，圓形或橢圓形，有的可見(jiàn)突起；而模型組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，排列松散，胞體變小，核固縮；藥物組可見(jiàn)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較模型組增多，排列較致密，胞體變大。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分

8、析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬CA1區(qū)相同面積內(nèi)ERK1、ERK2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低，陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度降低(P<0.05)；而藥物組ERK1、ERK2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度增加，與模型組比較有顯著差別(P<0.05)，與假手術(shù)組之間無(wú)顯著差別(P>0.05)。(5)海馬CA3區(qū)p-ERK的表達(dá)情況：p-ERK陽(yáng)性部位主要位于CA3區(qū)輻射層(樹突)，假手術(shù)組免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕褐色，染色較深，樹突稠密，側(cè)支豐富；而模

9、型組免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物染色較淡，樹突稀疏，側(cè)支較少，平均光密度低于假手術(shù)組(P<0.05)；藥物組較模型組明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)，并且與假手術(shù)組無(wú)顯著差別(P>0.05)。 結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)成功地建立了VD小鼠模型，經(jīng)跳臺(tái)試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了VD小鼠存在學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，能夠基本模擬臨床上VD的智能障礙，海馬HE染色顯示錐體細(xì)胞受損，是比較理想的VD動(dòng)物模型；同時(shí)，也證實(shí)了鹽酸多奈哌齊的治療效果。(2)采用免疫組織化學(xué)方法