雄黃對發(fā)育中的大鼠腦組織內氨基酸類神經遞質水平的影響.pdf

1、前言:
　　 雄黃(Realgar),系硫化物類礦物雄黃族雄黃的礦石,味辛、溫,有毒,歸心,肝,胃經,用于解毒殺蟲,燥濕,去痰,截瘧等。在現(xiàn)行四大國家標準收載的全部中藥制劑中,含雄黃的制劑多達2.80%(194/6938)。同時雄黃也是《醫(yī)療用藥毒性藥品管理辦法》特別規(guī)定的28種毒性中藥之一。近年長期、超量和不規(guī)范使用單味雄黃或其復方制劑引起不良反應或慢性砷中毒事件時有報道,其中不少是新生兒、少兒濫用所致,因而雄黃對人體健康的影

2、響成為了人們近年來關注的焦點。雄黃主要成分為二硫化二砷(As2S2)或四硫化四砷(As4S4),含有少量As2O3[iAs(Ⅱ),即砒霜]和As2O5[iAs(Ⅴ)]。無機砷在體內經過氧化甲基化和還原,可產生多種甲基化代謝產物[—甲基胂酸(monomethyl-arsenicacid,MMA),二甲基胂酸(di-methylarsenicacid,DMA)等],其中MMA(Ⅲ)的急性毒性最強,是iAs(Ⅲ)的4倍,這些代謝產物隨血液分布

3、到全身各組織器官或系統(tǒng),造成機體損傷。流行病學調查顯示長期暴露砷的兒童注意力、語言能力和長期記憶力均下降。動物實驗表明,砷是一種發(fā)育毒物,可通過血腦屏障進入腦組織并蓄積,導致實驗動物的智力和認知能力等學習和記憶方面的障礙。因此,闡明雄黃損害學習記憶功能及其毒作用機制對于早期采取有效措施保護少年兒童健康具有重要的經濟和社會意義。
　　 材料與方法:
　　 中國醫(yī)科大學實驗動物部提供4周齡Wistar大鼠64只,體重50±1

4、0g,雌雄各半,正式實驗前適應性飼養(yǎng)1周,按體重隨機分成8組,每組8只,以0.5%CMC-Na水溶液為混懸介質,1-2組為低劑量組灌胃給藥劑量為0.3g/kg,第3-4組為中劑量組給藥劑量為0.9g/kg,第5-6組為高劑量組給藥劑量為2.7g/kg,7-8組為對照組(0.5%CMC-Na水溶液),每個劑量組內的2個小組分別飼養(yǎng)2、6周。每日1次,在動物灌胃期間每3天稱重1次,調節(jié)灌胃劑量。所有動物均自由飲水和進食普通飼料。最后一次灌胃

5、2h后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,迅速開顱取大腦待用(冰浴下進行)。
　　 第一部分實驗:采用冷阱捕集.氫化物發(fā)生.原子吸收法測定雄黃染毒2周大鼠腦組織中形態(tài)砷的含量,雄黃染毒6周大鼠腦組織和血中形態(tài)砷的含量。
　　 第二部分實驗:采用柱前衍生化-高效液相色譜紫外檢測法測定雄黃染毒2周、6周后,大鼠腦組織中氨基酸類神經遞質的含量及方法學考察。
　　 結果:
　　 在大鼠血液中檢測到iAs、MMA和D

6、MA,而腦組織中僅檢測到MMA和DMA,未檢測到iAs。雄黃灌胃2周和6周后,與對照組比較,各劑量組大鼠腦組織中MMA、DMA和Tas含量水平均顯著增加(P<0.01,P<0.05)。比較染毒6周和2周大鼠腦組織中蓄積的砷量,發(fā)現(xiàn)6周大鼠腦組織中砷含量遠遠高于2周大鼠腦組織中的砷含量。實驗結果提示雄黃代謝產物MMA和DMA可通過血腦屏障在腦組織中蓄積,腦中砷代謝速度較慢,并且腦中MMA、DMA和Tas的量隨著雄黃染毒劑量的增加和染毒時間

7、的延長而升高,說明長期服用雄黃易于引起慢性砷中毒。
　　 實驗表明,幼鼠連續(xù)染毒2周后,經統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)高劑量雄黃染毒組大鼠腦組織中興奮性氨基酸Asp含量與對照組比明顯降低(P<0.05);但低劑量雄黃染毒組大鼠腦組織中抑制性氨基酸GABA和Tau含量明顯高于對照組(P<0.05)。連續(xù)灌胃6周后,與對照組比較,Asp和Glu在雄黃染毒組大鼠腦組織中的含量均明顯減少(P<0.05)。染毒組大鼠腦組織中抑制性氨基酸Gly含量減少,低

8、劑量和高劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);GABA在低、中劑量組含量低于對照組,差異無統(tǒng)計學意義;各染毒劑量組大鼠腦組織中Tau含量水平與對照組比也顯著降低(P<0.05)。
　　 比較染毒2周和染毒6周的實驗結果發(fā)現(xiàn),大鼠腦內Asp在染毒2周后高劑量組明顯降低,染毒6周后低、中、高劑量組均明顯降低(p<0.05);大鼠腦內Gly在染毒2周后,有降低趨勢,染毒6周后各劑量組均明顯降低(p<0.05);大鼠腦內G

9、ly在染毒2周后,低、中劑量組含量均增加,但低劑量組有統(tǒng)計學意義,高劑量組的含量明顯降低,染毒6周后各劑量組均明顯降低(p<0.05);大鼠腦內GABA在染毒2周后,低劑量組含量增加(p<0.05),中、高劑量組的含量稍又降低,染毒6周后各劑量組均均降低,但沒有統(tǒng)計學意義;大鼠腦內Tau在染毒2周后,低劑量組含量顯著增加(p<0.05),中、高劑量組的含量雖有降低,但無統(tǒng)計學意義,染毒6周后各劑量組均明顯降低(p<0.05)。灌胃2周后

10、染毒組大鼠興奮性氨基酸和抑制性氨基酸平衡常數(shù)K與對照組比有降低趨勢,但沒有統(tǒng)計學差異;灌胃6周后,染毒組大鼠平衡常數(shù)K與對照組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義,說明長期服用雄黃可引起氨基酸代謝平衡失調。
　　 建立了柱前衍生化的HPLC法測定大鼠腦中5種氨基酸類神經遞質含量的方法,經方法學考察該方法結果發(fā)現(xiàn)以pH9.5的碳酸鹽為衍生化緩沖液,與0.2mL10mmol/L的丹磺酰氯在65℃反應25min的條件下各氨基酸的衍生化效率最

11、大,該方法重復性、日間精密度良好。衍生化后的腦組織樣品在12h內、3次凍融循環(huán)及-70。C條件下貯存20天后5種氨基酸均很穩(wěn)定,其回收率在87.7%-107.2之間,表明該方法準確、靈敏、可靠、檢出限低。
　　 結論:
　　 1、雄黃在大鼠體內的代謝產物為iAs、MMA和DMA,并且以DMA為主。其中MMA和DMA可以通過血腦屏障進入并蓄積腦中,并且腦中MMA、DMA和Tas的量隨著雄黃染毒劑量的增加和時間的延長而升高。