紅脂大小蠹嗅覺相關(guān)基因表達譜及其OBPs功能研究.pdf

1、作為地球上種類和數(shù)量最為龐大的動物類群之一，昆蟲在其漫長的自然選擇過程中逐漸衍生出一套精密的嗅覺感受系統(tǒng)，正是依賴著自身嗅覺系統(tǒng)的靈敏性、專一性等特點，昆蟲得以從紛繁復雜的化學氣味中，篩選并識別出與自身生命活動相關(guān)的信息，從而完成覓食、交配、產(chǎn)卵、趨避等重要的生命活動。因此，嗅覺系統(tǒng)在昆蟲的生存繁衍的過程中扮演著重要的角色，有關(guān)昆蟲嗅覺系統(tǒng)的研究，是揭示昆蟲生存奧秘的必要且極其重要的環(huán)節(jié)之一。
　　紅脂大小蠹(Dendrocton

2、us valens，Red Turpentine Beetle，RTB)在分類學上屬鞘翅目小蠹科(Coleoptera: Scolytidae)，大小蠹屬(Dendroctonus)，其原產(chǎn)地為美國和加拿大等北美地區(qū)，主要蛀食松杉類針葉樹種樹干，為害松屬、黃杉屬、冷杉屬等超過35種植物的根部和干部。在我國，紅脂大小蠹的寄主主要為油松，它們通過蛀食油松樹干危害樹體的健康，其蔓延擴散速度極為迅猛。紅脂大小蠹能夠通過自身的嗅覺感受系統(tǒng)靈敏地識

3、別來周圍環(huán)境中各種復雜的化學信號，從而進行各種生命活動，完成自身種群的繁衍和擴散。已有研究證實，嗅覺相關(guān)的基因，如氣味結(jié)合蛋白(Odorantbinding proteins，OBPs)基因，化學感受蛋白(Chemosensory proteins，CSPs)基因，氣味受體（Olfactory receptors，ORs）基因等，在紅脂大小蠹識別和篩選外界氣味物質(zhì)過程中起到了重要作用。
　　本試驗在前期對紅脂大小蠹嗅覺基因鑒定的基

4、礎(chǔ)上，對其OBPs、CSPs兩類基因在其不同組織器官內(nèi)的表達情況進行分析;并進一步對DvalOBP3和DvalOBP16兩個在紅脂大小蠹體內(nèi)高表達的基因進行體外蛋白表達，驗證其蛋白與紅脂大小蠹生命活動相關(guān)的8種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。后續(xù)，又對紅脂大小蠹氣味降解酶相關(guān)基因進行了發(fā)掘和初步歸類分析，主要結(jié)果如下:
　　1.紅脂大小蠹氣味結(jié)合蛋白(OBPs)表達譜研究
　　利用RT-qPCR對已鑒定得到的21個紅脂大小蠹OBP基因進

5、行表達分析。結(jié)果表明，DvalOBP在紅脂大小蠹成蟲的觸角上皆有不同程度的表達。12個DvalOBP基因(DvalOBP1-5、DvalOBP12、DvalOBP14-18、DvalOBP20）呈現(xiàn)出觸角特異（高）表達的特點;DvalOBP13、DvalOBP19在紅脂大小蠹的足，翅中呈特異（高）表達的特點;DvalOBP6、DvalOBP8-11、DvalOBP20在紅脂大小蠹幼蟲期和蛹期的表達量要明顯高于成蟲觸角、足、翅等組織的表達

6、量。
　　2.紅脂大小蠹化學感受蛋白(CSPs)表達譜研究
　　利用RT-qPCR對已鑒定得到的6個紅脂大小蠹CSP基因進行表達分析。結(jié)果顯示:DvalCSP基因具有廣泛的表達譜，在紅脂大小蠹的不同組織，不同的生長時期皆有分布。其中，DvalCSP5在紅脂大小蠹足和翅中呈現(xiàn)特異（高）表達特點;DvalCSP2，DvalCSP5在紅脂大小蠹成蟲的4個組織中的表達量普遍較高，蛹和幼蟲期表達量微弱，并有雌性觸角高表達現(xiàn)象;Dval

7、CSP4，DvalCSP5，DvalCSP6在紅脂大小蠹的雌雄觸角中的表達量微弱。
　　3.紅脂大小蠹味氣味結(jié)合蛋白(OBPs)基因功能的研究
　　利用熒光競爭結(jié)合實驗探究DvalOBP3，DvalOBP16兩個在紅脂大小蠹觸角高表達的氣味結(jié)合蛋白與8種紅脂大小蠹生命活動相關(guān)的氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。試驗結(jié)果顯示:在與4種紅脂大小蠹信息素結(jié)合的過程中，DvalOBP3與桃金娘烯醛的結(jié)合能力最強，與順-馬鞭草烯醇和反-馬鞭草烯醇的

8、結(jié)合能力較弱，與桃金娘烯醇沒有明顯結(jié)合反應。DvalOBP16與4種信息素有一定的結(jié)合能力，與反-馬鞭草烯醇的結(jié)合能力最強。DvalOBP3和DvalOBP16對4種寄主植物所產(chǎn)生的萜烯類化合物都具有一定的結(jié)合能力，且這兩種蛋白與同種寄主揮發(fā)物質(zhì)的結(jié)合能力表現(xiàn)出相似性。
　　4.紅脂大小蠹氣味降解有關(guān)基因的鑒定與分析
　　對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行同源比對，鑒定得到49個細胞色素P450基因(cytochromeP450s，CYP45