IGF-1在大鼠肝纖維化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及扶正化瘀方對(duì)肝纖維化的影響.pdf

1、目的:肝纖維化(hepatic fibrosis)是各種致病因素引起肝細(xì)胞損傷,繼發(fā)肝臟炎癥及肝組織自我修復(fù)的一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程。該過(guò)程致使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成和降解失衡,從而引起ECM在肝組織內(nèi)過(guò)度沉積形成肝纖維化,甚則肝硬化。在肝纖維化形成的過(guò)程中,細(xì)胞因子起了關(guān)鍵性的作用。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是分泌各種細(xì)胞因子和產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞,HSC的

2、激活、增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在HSC增殖、活化及合成ECM的肝纖維化過(guò)程中,多種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)發(fā)揮著重要調(diào)控作用。在生理狀態(tài)下,ECM的合成和降解處于一種動(dòng)態(tài)平衡,從而維持肝臟的正常的組織結(jié)構(gòu)及功能。然而,各種致病因素?fù)p傷肝臟,使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng),炎性

3、細(xì)胞因子使HSC由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài),分泌各種細(xì)胞因子,促使HSC活化、增殖,同時(shí)產(chǎn)生ECM,使其在肝臟內(nèi)沉積,形成纖維化甚則硬化。IGF-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及機(jī)體代謝等的一種多肽類生長(zhǎng)因子。體外研究發(fā)現(xiàn)IGF-1能夠促進(jìn)HSC活化、增殖和膠原合成,促進(jìn)肝纖維化形成。然而,IGF-1在肝纖維化過(guò)程中的變化仍不十分明確。肝纖維化是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)之路。肝硬化是慢性肝病終末階段,可出現(xiàn)多種并發(fā)癥,給患者造成極大痛苦

4、。肝纖維化的治療是控制肝硬化發(fā)生的關(guān)鍵。現(xiàn)已證實(shí)干擾素及核苷(酸)類似物,能通過(guò)抑制病毒復(fù)制,減輕炎癥反應(yīng),抑制纖維化形成。然而,目前臨床上抗肝纖維化的西藥種類及療效有限。中藥以其多途徑、多靶點(diǎn)的治療調(diào)節(jié)作用在抗肝纖維化中發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。扶正化瘀方主要由丹參、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、松花粉、桃仁、絞股藍(lán)等組成,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有活血祛瘀,益精養(yǎng)肝的作用,現(xiàn)代研究認(rèn)為其能有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化。因此,我們建立了四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,以探

5、討IGF-1在實(shí)驗(yàn)性肝纖維化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化,同時(shí)用扶正化瘀方進(jìn)行干預(yù),觀察扶正化瘀方對(duì)肝纖維化形成的影響及其對(duì)IGF-1的作用,為尋求有效的抗肝纖維化藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)分兩部分
　　 第一部分:IGF-1在實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化
　　 選取雄性wistar大鼠66只,隨機(jī)分為對(duì)照組,模型組。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水,模型組給予30％CCL4橄欖油腹腔注射,均為每周2次,共8

6、周。于造模的第4周末開(kāi)始,每隔2周,隨機(jī)取模型組大鼠6只處死,對(duì)照組3只處死,觀察至第14周末。
　　 第二部分:扶正化瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化及肝組織IGF-1的影響
　　 選取雄性wistar大鼠57只,隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和扶正化瘀方干預(yù)組。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水,每周2次,共8周;模型組給予30％CCL4橄欖油腹腔注射,每周2次,共8周;干預(yù)組造模方式同模型組,同時(shí)給予扶正化瘀方藥液灌胃,每日1次,共8周。于第4、

7、6、8周末隨機(jī)取模型組及干預(yù)組大鼠6只處死,對(duì)照組3只處死。
　　 將大鼠處死后,留取血和肝組織標(biāo)本,檢測(cè)血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST);蘇木素-伊紅(HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改變;免疫組織化學(xué)染色法觀察肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、IGF-1蛋白的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)IGF-1 mRNA的表達(dá);堿水解法檢測(cè)肝組織羥脯氨酸(

8、hydroxyproline,Hyp)的含量。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:IGF-1在實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化
　　 1：血清學(xué)指標(biāo)
　　 模型組大鼠血清ALT、AST在第4、6、8周逐漸升高,第10周開(kāi)始降低,在第14周時(shí)仍高于對(duì)照組。模型組大鼠各時(shí)間段ALT和AST均高于對(duì)照組。
　　 2：肝組織病理學(xué)變化
　　 HE及Masson染色:對(duì)照組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)

9、構(gòu)正常,肝細(xì)胞條索走行整齊,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),在血管壁、匯管區(qū)可見(jiàn)少量纖維結(jié)締組織存在;模型組在第4周的肝組織,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,可見(jiàn)肝細(xì)胞變性、壞死,大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);第6周在第四周基礎(chǔ)上可見(jiàn)肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性,匯管區(qū)逐漸可見(jiàn)大量纖維組織增生;第8周時(shí)肝細(xì)胞脂肪變性基本消失,可見(jiàn)大量纖維條索,假小葉形成明顯。后期炎性細(xì)胞逐漸減少,纖維結(jié)締組織減少。
　　 3：肝組織α-SMA和IGF-1蛋白表達(dá)
　　 3.1：肝組

10、織α-SMA蛋白表達(dá):免疫組織化學(xué)染色顯示α-SMA在模型組各時(shí)間段與對(duì)照組相比均明顯增加。對(duì)照組α-SMA僅在血管壁上有表達(dá);隨造模時(shí)間延長(zhǎng),模型組α-SMA表達(dá)逐漸增強(qiáng),在血管壁、匯管區(qū)及纖維間隔均有陽(yáng)性表達(dá),第10周后逐漸減少。
　　 3.2：肝組織IGF-1蛋白表達(dá):免疫組織化學(xué)染色顯示對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞漿表達(dá)少量IGF-1蛋白;模型組在第4、6、8周IGF-1表達(dá)逐漸增加,IGF-1在肝細(xì)胞漿及細(xì)胞膜均有表達(dá),并在后期隨

11、著肝組織炎癥及纖維化減輕,表達(dá)逐漸減少。
　　 4：肝組織IGF-1 mRNA的表達(dá)
　　 RT-PCR檢測(cè)顯示模型組各時(shí)間段肝組織IGF-1 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加,第8周IGF-1 mRNA表達(dá)為最高,以后隨著CCL4應(yīng)用的停止和肝纖維化的好轉(zhuǎn),IGF-1 mRNA表達(dá)逐漸減少。
　　 5：肝組織Hyp檢測(cè)
　　 模型組隨著CCL4的應(yīng)用,肝組織Hyp含量逐漸增加,到第8周達(dá)到高峰,以后隨著C

12、CL4的停用和肝纖維化的逆轉(zhuǎn),Hyp含量逐漸降低。模型組各時(shí)間點(diǎn)肝組織Hyp含量均高于對(duì)照組。
　　 6：肝組織Hyp含量與肝組織α-SMA和IGF-1蛋白表達(dá)的相關(guān)關(guān)系
　　 IGF-1和α-SMA蛋白表達(dá)與肝組織Hyp含量間存在直線相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.953和0.944(P＜0.01)。
　　 第二部分:扶正化瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化及肝組織IGF-1的影響
　　 1：血清學(xué)指標(biāo)
　　 模

13、型組及扶正化瘀干預(yù)組大鼠血清ALT、AST在第4、6、8周時(shí)較對(duì)照組明顯升高,干預(yù)組大鼠血清ALT、AST在相應(yīng)時(shí)間段均顯著低于模型組。
　　 2：肝組織病理學(xué)變化
　　 HE及Masson染色:對(duì)照組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞條索排列整齊,在血管壁和匯管區(qū)可見(jiàn)少量纖維結(jié)締組織;模型組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,可見(jiàn)肝細(xì)胞變性、壞死,大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn),隨纖維化進(jìn)展,大量纖維組織增生逐漸增多,假小葉形成;干預(yù)組大鼠肝組

14、織與同時(shí)間段模型組相比炎癥及纖維化程度均有明顯減輕。
　　 3：肝組織α-SMA和IGF-1蛋白表達(dá)
　　 3.1：肝組織α-SMA蛋白表達(dá):免疫組織化學(xué)染色顯示對(duì)照組α-SMA僅在血管壁上有表達(dá);隨造模時(shí)間延長(zhǎng),模型組α-SMA表達(dá)逐漸增強(qiáng),在血管壁、匯管區(qū)及纖維間隔均有陽(yáng)性表達(dá)。干預(yù)組α-SMA較模型組同時(shí)間段的表達(dá)均顯著降低。
　　 3.2肝組織IGF-1蛋白表達(dá):免疫組織化學(xué)染色顯示對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞漿表達(dá)

15、少量IGF-1蛋白;模型組IGF-1表達(dá)較對(duì)照組增加;干預(yù)組與同時(shí)期模型組IGF-1表達(dá)相比均明顯減少。
　　 4：肝組織IGF-1 mRNA的表達(dá)
　　 RT-PCR檢測(cè)顯示模型組與干預(yù)組肝組織IGF-1 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加,趨勢(shì)與IGF-1蛋白表達(dá)一致;干預(yù)組IGF-1 mRNA在各時(shí)間段表達(dá)均明顯低于模型組。
　　 5：肝組織Hyp檢測(cè)
　　 模型組與干預(yù)組Hyp含量與對(duì)照組相比均顯著增

16、加,干預(yù)組Hyp含量在各時(shí)間段表達(dá)均明顯低于模型組。
　　 結(jié)論:
　　 1：大鼠經(jīng)CCL4腹腔注射8周,可誘導(dǎo)典型的肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型,其病理特征符合人類肝纖維化特點(diǎn)。
　　 2：IGF-1與肝組織纖維化程度及炎癥壞死程度密切相關(guān),可能具有促進(jìn)肝纖維化的作用。
　　 3： IGF-1與肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致,并且IGF-1、α-SMA的蛋白表達(dá)均與Hyp含量呈直線相關(guān)關(guān)系,IGF-1可能通