深度燒傷真皮基質(zhì)的制備及其生物學(xué)性能評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　皮膚作為人體最大的器官，其在調(diào)節(jié)體溫、排泄代謝廢物以及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面均發(fā)揮著重要作用。但是，皮膚在日常生活以及戰(zhàn)（創(chuàng)、燒）傷中也最易受到損傷。輕度受損的皮膚可以依據(jù)其未損傷的細(xì)胞與組織為模板，依靠皮膚自身的再生潛力完成其自我修復(fù)的過(guò)程;但重度大面積損傷的皮膚卻喪失其原有的組織結(jié)構(gòu)與功能，皮膚中具備修復(fù)潛能的干細(xì)胞與組織被嚴(yán)重破壞，其自我修復(fù)的潛能也隨之喪失殆盡。目前對(duì)于大面積深度燒傷的治療，仍存在諸多困難，如

2、愈合后瘢痕攣縮、供體皮膚來(lái)源不足、異體或異種皮的免疫排斥反應(yīng)等。隨著組織工程學(xué)的誕生，人們開(kāi)始應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)及醫(yī)學(xué)科學(xué)等原理和技術(shù)構(gòu)建各類皮膚替代物。因此，如何能在皮膚損傷的早期利用各項(xiàng)技術(shù)和措施來(lái)修復(fù)與重建損傷皮膚已經(jīng)成為當(dāng)前皮膚再生研究的新方向。
　　脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)(acellular allogeneic dermal matrix，allo-ADM)是用理化方法脫除異體表皮和真皮中所有細(xì)胞成份，

3、保留細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并完整保留位于表皮層和真皮層之間的基底膜。其具有完整的膠原三維結(jié)構(gòu)和高生物相容性，是一種良好的真皮替代物，在組織成分上與自體皮膚最相近，可以作為一種理想的皮膚移植物。由于除去了表皮和真皮中可引發(fā)被宿主識(shí)別的外來(lái)細(xì)胞成份從而去除了抗原性，移植在受體創(chuàng)面上不發(fā)生免疫排斥，為永久性真皮覆蓋物。Allo-ADM的存在為受體成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞重新定植和血管新生提供了良好的誘導(dǎo)支架，在allo-ADM中重新定居的成纖維

4、細(xì)胞保持產(chǎn)生成熟基質(zhì)的能力。另外，基底膜的存在非常有利于二表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖與分化。但由于基底膜仍具有較強(qiáng)的免疫原性，且異體皮來(lái)源主要來(lái)源為保存完好的尸體皮，來(lái)源十分有限，受到倫理學(xué)的制約，且存在有傳染疾病的危險(xiǎn)，其應(yīng)用受到極大的限制。
　　異種無(wú)細(xì)胞真皮基質(zhì)(xenogeneic acellular dermal matrix， xeno-ADM)也是真皮基質(zhì)的來(lái)源之一，最常用的異種真皮為豬皮。豬皮和人的皮膚在組織結(jié)構(gòu)物性狀和免

5、疫方面有許多相似之處，且來(lái)源廣泛，是異種真皮的最佳材料。Xeno-ADM的制作同allo-ADM的制作基本相同，處理后也去除了誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)的細(xì)胞成分并且保留了完整的細(xì)胞外基質(zhì)。但由于物種間存在組織蛋白的差異，xeno-ADM的免疫原性要比allo-ADM強(qiáng)。Xeno-ADM的應(yīng)用存在缺陷:存在較強(qiáng)的免疫原性;血管化速度緩慢;潛在異源性病毒微生物感染風(fēng)險(xiǎn)。
　　我們?cè)谝酝难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在深Ⅱ度燒傷和混合燒傷中，存在一種沒(méi)有全層壞

6、死的特殊真皮組織，此類組織中可見(jiàn)細(xì)胞新陳代謝障礙、細(xì)胞功能低下、形態(tài)學(xué)改變等一系列變化，但在局部環(huán)境改善后，具有可逆恢復(fù)至正常形態(tài)和功能的特點(diǎn)，通常把這部分沒(méi)有完全壞死的真皮稱為變性真皮。由于熱損傷等損傷因素存在，變性真皮中含有大量細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)降解物，其具有多種強(qiáng)大的生物學(xué)活性，包括誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、促進(jìn)細(xì)胞增殖等，稱為細(xì)胞外基質(zhì)活性肽。細(xì)胞外基質(zhì)活性肽可對(duì)傷患產(chǎn)生極大影響，可

7、引起休克、心律失常等致命并發(fā)癥。以往的經(jīng)驗(yàn)是將變性皮膚視為焦痂或痂皮，將其切除后覆蓋臨時(shí)覆蓋物，近年來(lái)有學(xué)者提出可行磨痂術(shù)以保留變性真皮，可以促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合。但其中的細(xì)胞外基質(zhì)活性肽仍然會(huì)對(duì)傷患產(chǎn)生不利影響。因此，我們提出，能否將燒傷皮膚完全切除，利用組織工程學(xué)相關(guān)處理措施，祛除其中的不利因素，利用其中的膠原成分和部分活性因子，變成一種新型的真皮支架，使其廢物利用，發(fā)揮更為合理、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，既可以減少免疫排斥和炎性反應(yīng)，又能加

8、速燒傷創(chuàng)面的愈合。
　　在本研究中，我們將深度燒傷皮膚進(jìn)行了組織工程學(xué)加工，將真皮基質(zhì)中的降解物進(jìn)行無(wú)害化處理，制作了深度燒傷真皮基質(zhì)(Deep-degree burned dermalmatrix，DDBDM)，對(duì)其進(jìn)行了理學(xué)性能及生物學(xué)性能初步評(píng)價(jià)。并選擇小鼠作為研究對(duì)象，針對(duì)其中的細(xì)胞因子進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片實(shí)驗(yàn)，明確脫細(xì)胞措施對(duì)其中的細(xì)胞因子有何影響。
　　方法：
　　1.深度燒傷動(dòng)物模型的建立:
　　選用Wi

9、star大鼠、昆明小鼠、Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用恒溫恒壓燙傷法及恒溫水浴燙傷法作為致傷方法，根據(jù)致傷深度均勻性及可重復(fù)性優(yōu)選出最佳的致傷方法。
　　2.DDBDM的制備及其物理性能和生物相容性評(píng)價(jià)
　　2.1 DDBDM的制備方法篩選及其優(yōu)化:切取燒傷部位皮膚進(jìn)行胰蛋白酶-TritonⅩ-100方法進(jìn)行脫細(xì)胞處理，按其濃度不同分為A組:0.1％胰蛋白酶、0.1％TritonⅩ-100組，B組:0.25％胰蛋白酶、0

10、.5％TritonⅩ-100組，C組:0.5％胰蛋白酶、1％TritonⅩ-100組，設(shè)定恒溫振蕩儀于37℃，設(shè)定振蕩頻率為100rpm，設(shè)置不同振蕩時(shí)間1h、2h、4h，使用無(wú)菌PBS緩沖液進(jìn)行振蕩漂洗，直至PBS溶液變清亮。根據(jù)制得的真皮支架的完整性及其脫細(xì)胞的程度進(jìn)行制備條件的初步篩選。
　　2.2 根據(jù)DDBDM的大體觀察、組織學(xué)觀察、物理性能檢測(cè)、生物相容性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行DDBDM的性能評(píng)價(jià)。
　　2.2.1 DDB

11、DM的一般性能評(píng)價(jià)
　　2.2.1.1 觀察DDBDM的外觀、厚度、色澤、彈性情況等指標(biāo)并記錄。
　　2.2.1.2 物理性能檢測(cè):將DDBDM進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定、降解率測(cè)定，評(píng)價(jià)其一般性能。
　　2.2.1.3 組織學(xué)檢查及評(píng)價(jià):將DDBDM進(jìn)行HE染色，觀察膠原排列變化情況。
　　2.2.2 DDBDM的生物相容性評(píng)價(jià)
　　按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)之醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)方法之第6部分:植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)(G

12、B/T16886.6-1997)進(jìn)行小鼠背部植入實(shí)驗(yàn)，以ADM為對(duì)照，觀察DDBDM的纖維化和炎癥程度、材料/組織界面炎性細(xì)胞類型及其數(shù)量和分布、確定DDBDM是否存在壞死及DDBDM溶解程度、肉芽腫形成情況等。
　　3.DDBDM與ADM細(xì)胞因子差異分析
　　以Balb/c小鼠為研究對(duì)象，將正常皮膚、深度燒傷皮膚、ADM與DDBDM進(jìn)行細(xì)胞因子蛋白芯片實(shí)驗(yàn)，研究其中308中細(xì)胞因子水平變化，并將其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察燒傷及

13、脫細(xì)胞過(guò)程對(duì)其中細(xì)胞因子變化的影響作用并分析其相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.恒溫恒壓電燙儀和恒溫水浴燙傷法是穩(wěn)定的可重復(fù)制作深度燒傷動(dòng)物模型的可靠方法，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，使用恒溫水浴燙傷法能制作更穩(wěn)定及燙傷深度更均勻的深度燙傷動(dòng)物模型。
　　2.將深度燒傷皮膚放置于0.25％胰蛋白酶-0.5％TritonⅩ-100混合溶液中，并于37℃恒溫振蕩儀中，在一定頻率下進(jìn)行脫細(xì)胞處理后，可成功制備深度燒傷真皮基質(zhì)(DDBDM)，其

14、一般性能符合真皮替代物的基本條件。
　　3.經(jīng)過(guò)皮下埋植實(shí)驗(yàn)證實(shí)DDBDM具有良好的生物相容性。
　　4.經(jīng)細(xì)胞因子蛋白芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí): DDBDM中比ADM無(wú)過(guò)多的有害細(xì)胞因子，其中部分細(xì)胞因子水平的變化有減少瘢痕形成，促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。
　　結(jié)論：
　　在本研究中，DDBDM的制作方法被最終確定;將ADM和DDBDM中的細(xì)胞因子進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，DDBDM中沒(méi)有過(guò)多的有害細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的損害。

15、所以DDBDM可以成為一種理想的真皮替代物材料。如果能有一種有效方法來(lái)減少對(duì)組織有害的炎性因子，且能夠更有效的利用其中的有益細(xì)胞因子，那么可以減少其副作用，而且可以提高它的良性作用比如種子細(xì)胞的浸潤(rùn)、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)重建。由于DDBDM來(lái)源于自體真皮基質(zhì)，異源性或異體真皮基質(zhì)的組織不相容性則不存在。然而，本實(shí)驗(yàn)有局限性，有關(guān)調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)未能實(shí)施，所以在體內(nèi)這些細(xì)胞因子如何發(fā)揮效應(yīng)未能得知。而且，應(yīng)用DDBDM作為真皮替代物