新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后海馬神經(jīng)細胞自噬檢測及雷帕霉素對預后的干預.pdf

1、目的:研究新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)后海馬組織中神經(jīng)元細胞的損傷情況,通過觀察不同時間點及各組間細胞死亡、自噬相關蛋白的表達,初步探討雷帕霉素對HIBD后神經(jīng)元存活的干預作用。
　　方法:采用7日齡新生SD(Sprague Dawley)大鼠,根據(jù)改良Rice-Vannucci法建立HIBD模型。將新生大鼠隨機分為雷帕霉素干預組(Ra組)、缺氧缺血組(HIBD組

2、)及假手術組(Sham組)。選取HIBD模型制成后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h及72h六個時間點,通過Western blot法測定海馬組織中Cleaved caspase-3、Beclin-1、LC3蛋白濃度的變化;采用免疫組織化學法染色觀察海馬組織Cleaved caspase-3染色情況,結合HE染色及尼氏染色從細胞層面了解海馬區(qū)域神經(jīng)細胞發(fā)生缺氧缺血損傷后的轉歸情況,并探討應用自噬激動劑雷帕霉素對其發(fā)揮的干預作用

3、及可能機制。
　　結果:
　　1、HE染色結果:
　　1.1 Sham組腦組織海馬區(qū)域6個時間點HE染色后光鏡下觀察:海馬區(qū)域組織染色均勻、結構清晰,神經(jīng)細胞形態(tài)正常,胞質染色為淡紅色,胞核染色為藍色;
　　1.2 HIBD組腦組織HE染色后光鏡下觀察:缺氧缺血側海馬神經(jīng)細胞變性及壞死的程度隨時間的延長而加重,表現(xiàn)為海馬區(qū)域組織結構紊亂、間質水腫,神經(jīng)細胞腫脹甚至壞死,胞核出現(xiàn)深染、固縮、碎裂,核仁消失,伴有不同

4、程度的炎性細胞浸潤;
　　1.3 Ra組腦組織HE染色后光鏡下觀察:缺氧缺血側海馬神經(jīng)細胞出現(xiàn)變性及部分神經(jīng)細胞壞死,但程度及范圍均較HIBD組輕;
　　2、Western-blot結果:
　　2.1 Beclin-1蛋白:與Sham組相比,HIBD組該蛋白自0h起表達迅速升高,至24h達高峰,且每個時間點表達均顯著高于Sham組(P<0.05);與HIBD組相比,Ra組該蛋白表達趨勢與HIBD組一致,且每個時間點表達

5、均高于HIBD組,且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);
　　2.2 LC3II:與Sham組相比,HIBD組及Ra組的該蛋白表達在6個時間點的表達均高于Sham組,且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);HIBD組及Ra組該蛋白均從0h起開始上升,且Ra組的表達在每個時間點均高于HIBD組,除外12h這一時間點外,其它5個時間點均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);
　　2.3 Cleaved caspase-3蛋白:與Sham組相比,H

6、IBD組及Ra組該蛋白的表達除0h無明顯增加外,其余5個時間點均顯著升高,且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與HIBD組相比,Ra組該蛋白表達在每個時間點均低于HIBD組,但只有6h及12h具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);
　　3、Cleaved caspase-3蛋白免疫組織化學染色結果:
　　Sham組海馬區(qū)域各個時間點染色均較淺;與HIBD組相比,Ra組染色僅在6h及12h淺于HIBD組,且平均光密度值具有統(tǒng)計學意義(

7、P<0.05),其余時間點兩組無顯著差異(P>0.05);
　　4、尼氏染色結果:
　　與Sham組相比,HIBD組及Ra組每個時間點均存在不同程度的海馬區(qū)域結構紊亂、神經(jīng)細胞數(shù)量減少、細胞核碎裂、溶解及尼氏小體崩解及丟失,隨時間延長而加重;根據(jù)尼氏染色計數(shù)神經(jīng)細胞丟失數(shù)目,與HIBD組相比,Ra組均少于HIBD組,隨時間延長結果差異性越顯著,以48h及72h最明顯,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);
　　結論: