基于微囊懸浮流化床式反應器的肝細胞培養(yǎng)模式的研究.pdf

1、背景
　　 肝衰竭是國際性的治療難題。人工肝尤其是以培養(yǎng)肝細胞為基礎的生物人工肝的不斷發(fā)展與成熟為肝衰竭的治療開辟了新的途徑。到目前為止，國內外已有數(shù)個生物人工肝系統(tǒng)進入到Ⅰ-Ⅲ期臨床試驗，但將其應用到臨床并推廣使用，還存在諸多問題有待解決。其中首要問題是如何獲得足夠數(shù)量、高活性并且功能良好的肝細胞。因此，生物人工肝對肝細胞培養(yǎng)的規(guī)模和質量提出了更高的要求。
　　 目前已有多種培養(yǎng)技術被應用到生物人工肝的研究中，如微囊化

2、培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、反應器培養(yǎng)，流化培養(yǎng)及共培養(yǎng)等技術。為了揚長避短，多種培養(yǎng)方式結合可能更有利于維持或提高肝細胞的功能和活性，本實驗室前期已成功構建了基于微囊懸浮型流化床式反應器的新型生物人工肝系統(tǒng)，體外及動物實驗的初步結果是我們相信微囊懸浮流化床式反應器能夠為肝細胞大規(guī)模、高活性培養(yǎng)提供可靠的技術支持。
　　 目的
　　 本課題根據(jù)新型生物人工肝系統(tǒng)對肝細胞培養(yǎng)的要求，采用微囊化培養(yǎng)、共培養(yǎng)及流化培養(yǎng)技術相結合，旨在為

3、新型生物人工肝提供足量高活性、功能良好的肝細胞。
　　 方法
　　 1.確定制備微囊的穩(wěn)定條件，全面評價微囊的機械強度、物質通透性以及微囊內細胞的活性，為下一步的研究打下基礎。
　　 2.構建基于微囊流化床式反應器的培養(yǎng)系統(tǒng)，以單層貼壁培養(yǎng)(2D)為對照，采用微囊靜態(tài)培養(yǎng)(3D)、微囊共培養(yǎng)(3D-Co)、微囊流化培養(yǎng)(3D-F)、微囊流化共培養(yǎng)(3D-F-Co)等四種培養(yǎng)模式培養(yǎng)肝細胞，評價在不同模式下肝細胞的

4、合成能力和藥物代謝能力。
　　 3.采用蛋白質芯片、Realtime-PCR、Western Blot等技術初步研究肝細胞功能改變的機制。
　　 結果
　　 1.確定了兩種不同直徑(800μm，300μm)微囊的穩(wěn)定制備條件，制備的微囊具有良好的機械強度和物質通透性，微囊化的肝細胞在培養(yǎng)過程中保持很高的活性。
　　 2.不同培養(yǎng)模式下肝細胞功能評價結果顯示：微囊化培養(yǎng)相比單層貼壁培養(yǎng)優(yōu)勢明顯；微囊共培養(yǎng)能

5、夠顯著提高肝細胞的白蛋白合成能力和CYP1A2的活性；微囊流化培養(yǎng)能夠顯著提高肝細胞的合成能力和CYP1A2的活性；流化共培養(yǎng)在提高肝細胞的CYP3A4、CYP1A2的活性方面效果最顯著。
　　 3.HepLi3細胞功能與肝腫瘤細胞系相近，微囊流化培養(yǎng)系統(tǒng)能夠顯著提高其合成功能和CYP3A4、CYP1A2的活性。
　　 4.蛋白芯片分析顯示hPMSC細胞能夠分泌多種細胞因子參與調節(jié)肝細胞的增殖、凋亡和功能的發(fā)揮；Real

6、time-PCR結果顯示微囊化培養(yǎng)和共培養(yǎng)可顯著提高肝細胞功能相關基因的表達水平；WesternBlot結果顯示肝細胞CYP2E1、CYP1A2的蛋白表達量增高，微囊流化共培養(yǎng)能夠顯著下調肝細胞內PKC，ERK及PKA的磷酸化水平及鈣調蛋白的表達水平。
　　 結論
　　 1.基于微囊懸浮型流化床式反應器的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠維持并提高肝細胞活性和功能；微囊流化共培養(yǎng)為最佳的肝細胞培養(yǎng)模式。
　　 2.肝細胞功能的提高可能