轉(zhuǎn)染RI基因?qū)β殉舶┘毎鸋O-8910體外增殖抑制作用的實驗研究.pdf

1、核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)是一種酸性糖蛋白，分子量50KDa，能與RNaseA緊密結(jié)合抑制其對RNA的水解作用。血管生成因子(Ang)是腫瘤細胞和正常細胞分泌的具有強烈誘發(fā)血管生成活性的一種單鏈堿性蛋白質(zhì)，分子量 14.4KDa，是RNaseA超家族中的一員。Ang在組織細胞中分布廣泛，在腫瘤組織及正常組織中均有表達，提示其在體內(nèi)受到嚴格的調(diào)控。Ang的氨基酸殘基與RNaseA具有35﹪的同

2、源性，X射線分析表明它們有著及其相似的空間結(jié)構(gòu)，都可以作為配體與RI緊密結(jié)合，但Ang與RI有更大的親和力。被結(jié)合后的Ang便失去了促血管生成的活性，試驗也證實RI能有效的阻斷血管生成因子誘導的血管生成，從而減緩腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，達到治療腫瘤的目的。 卵巢癌是一種實體腫瘤，在腫瘤間質(zhì)中存在著高密度的微血管，卵巢癌的生長轉(zhuǎn)移與這些微血管相關。在惡性腫瘤細胞生長的初始階段，沒有自身的血管系統(tǒng)，局部營養(yǎng)主要靠效率很低的單純擴散方式提

3、供，不會發(fā)生轉(zhuǎn)移。當腫瘤體積超過1～2mm<'3>就需要新生血管維持營養(yǎng)和氧氣供給從而迅速生長并可發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤的新生毛細血管密度越高越有利于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，因此在惡性腫瘤發(fā)生時血管生成活躍，研究控制卵巢癌血管生成的方法對治療卵巢癌意義重大。 目前，雖然血管生成抑制劑治療卵巢癌已獲得肯定，但認為應用轉(zhuǎn)基因療法將特定基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞，使之持續(xù)表達從而達到持續(xù)抑制腫瘤血管生成的作用效果更顯著?；蛑委熢谀[瘤領域的成功應用為卵巢癌的

4、基因治療奠定了基礎，為治療卵巢癌展現(xiàn)了一個有希望的前景。 目的：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過脂質(zhì)體介導的方法將RI基因轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞HO-8910，探討RI基因?qū)υ撃[瘤細胞增殖的抑制作用。 方法： 1.將重組載體(plncx-RI)通過脂質(zhì)體介導的方法轉(zhuǎn)染HO-8910細胞。 2.用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞陽性克隆。 3.用RT-PCR的方法鑒定細胞中的RI基因，用免疫細胞化學的方法檢測細胞中RI

5、的表達。 4.通過細胞形態(tài)學觀察，細胞計數(shù)，MTT及流式細胞儀細胞周期分析研究轉(zhuǎn)染RI基因?qū)β殉舶┘毎鸋O-8910增殖的抑制作用。 結(jié)果： 1.用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HO-8910后用400ug/ml的G418篩選出陽性克隆。 2.經(jīng)RT-PCR鑒定RI基因已經(jīng)整合進HO-8910細胞基因組中。 3.通過免疫細胞化學檢測出在轉(zhuǎn)染后的細胞RI基因在胞漿內(nèi)有高表達。 4