原核表達(dá)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白6的條件優(yōu)化及活性分析.pdf

1、BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β超家族，具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)異位骨形成，促進(jìn)骨折愈合，及具有控制哺乳動(dòng)物骨骼不同形態(tài)特征形成的功能。BMP6是BMP家族中發(fā)現(xiàn)較晚的成員，以軟骨內(nèi)和膜內(nèi)成骨方式產(chǎn)生很強(qiáng)的骨誘導(dǎo)作用。BMP6的生物學(xué)作用不僅限于骨的生成，還參與心臟、肝臟、胰腺及小腸等多個(gè)器官的發(fā)育。由于BMPs在骨組織中含量甚微，通過基因重組技術(shù)制備rhBMP6(BMP6)可以滿足基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的需要。本實(shí)驗(yàn)

2、室在前期工作中采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)rhBMP6的重組大腸桿菌細(xì)胞株E.coli BL21(DE3)/pET-15b-BMP6，重組蛋白在細(xì)胞質(zhì)中以不溶的包涵體(IB)形式存在。本文主要對rhBMP6在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)條件、純化方法及包涵體溶解條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過復(fù)性，最終通過堿性磷酸酶活性(ALP)分析比較復(fù)性制備的rhBMP6與從R＆D公司購得的hBMP6標(biāo)準(zhǔn)品間的活性差異。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴優(yōu)化條件為L

3、B/Ampicillin(100μg/mL)，OD600nm l.400時(shí)加入1.0mmol/LIPTG，37℃誘導(dǎo)4小時(shí)，可獲得表達(dá)量占菌體蛋白80％以上的rhBMP6。
　　 ⑵簡化包涵體純化步驟后rhBMP6純度達(dá)到96％，含量為50mg rhBMP6/L LB。包涵體溶解條件確定為0.1mmol/L Tris-HCl(pH8.0)+0.25mol/L NaCl+0.4mol/LGdn-HCl，可得到10mg rhBMP6