脾臟T細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)對膿毒癥免疫功能的影響.pdf

1、目的:觀察膿毒癥大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡與免疫麻痹發(fā)生的相關(guān)性。觀察高糖皮質(zhì)激素血癥及T淋巴細(xì)胞過度活化兩種促凋亡因素對脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)及caspase3活性的影響，明確膿毒癥時脾臟T淋巴細(xì)胞的凋亡機制及調(diào)節(jié)因素。探討活血化瘀中藥調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞凋亡，改善膿毒癥免疫功能的作用及機制。 方法:第一部分首先以盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法制備膿毒癥大鼠模型，假手術(shù)組及模型組各10只，檢測模型的各項生理及生化指標(biāo)。然

2、后將96只Wistar大鼠隨機分為正常對照組（8只）、假手術(shù)組（8只）、膿毒癥組（40只）和中藥組（40只），中藥組動物行CLP術(shù)后予活血化瘀中藥注射。膿毒癥組和中藥組再分別分為4h、8h、24h、36h和48h五個時間點。分別于術(shù)后各個時間點以ELISA法檢測血清IL-2、IL-10水平，TUNEL法檢測脾細(xì)胞凋亡情況，流式細(xì)胞儀檢測脾臟淋巴細(xì)胞中CD3+細(xì)胞比例，分光光度法測定脾組織caspase3活性以及免疫組化法檢測脾組織Fas

3、、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。第二部分提取BAB/C小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)，分別以地塞米松和活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（AICD）方法進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)。于地塞米松誘導(dǎo)6h、16h及活化誘導(dǎo)18h后以流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞的凋亡率，并于地塞米松誘導(dǎo)6h及活化誘導(dǎo)6h、18h后RT-PCR法檢測T淋巴細(xì)胞內(nèi)Fas、FasL、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平，分光光度法測定細(xì)胞內(nèi)caspase3酶活性。同時觀察活血化瘀中藥對上述各項指

4、標(biāo)的影響。第三部分提取BAB/C小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)，觀察活血化瘀中藥對靜息及活化T細(xì)胞增殖活性影響的MTT檢測，流式細(xì)胞儀檢測中藥干預(yù)后靜息T淋巴細(xì)胞的自然凋亡率。再分別以地塞米松和活化誘導(dǎo)法進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，并以活血化瘀中藥進(jìn)行干預(yù)，RT-PCR法檢測T淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-2 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果:第一部分實驗中膿毒癥組大鼠于造模后出現(xiàn)脾組織caspase3活性升高、細(xì)胞凋亡數(shù)增多，而脾細(xì)胞中CD3+細(xì)胞比例明顯下降。并于造

5、模后36 h、48 h，血清IL-2水平明顯下降，IL-10水平顯著升高，顯示出免疫麻痹的表現(xiàn)。同時膿毒癥組脾組織Fas、FasL、Bax表達(dá)明顯增多，Bcl-2表達(dá)下降。活血化瘀中藥干預(yù)后可提高IL-2水平，降低IL-10水平，減輕脾組織caspase3活化程度，減少脾細(xì)胞凋亡，并使CD3+細(xì)胞比例恢復(fù)正常。同時可明顯降低脾組織Fas、FasL、Bax表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)。第二部分實驗中地塞米松誘導(dǎo)6h后T淋巴細(xì)胞凋亡率即明顯增加

6、，至16 h細(xì)胞較少存活。誘導(dǎo)6h后T淋巴細(xì)胞內(nèi)Bax mRNA表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)下降，F(xiàn)as mRNA表達(dá)無變化，無FasL mRNA表達(dá)。以活化誘導(dǎo)凋亡的T淋巴細(xì)胞于誘導(dǎo)18 h后細(xì)胞凋亡率明顯增加，于誘導(dǎo)6h時未見FasL、Bax mRNA表達(dá)，F(xiàn)as、Bcl-2 mRNA表達(dá)無明顯變化；于誘導(dǎo)18 h后Fas、FasL、Bax mRNA表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)下降，caspase3活性增高。活血化瘀中藥

7、可降低兩種促凋亡因素誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡，并可分別降低Fas、FasL、Bax mRNA表達(dá)，提高Bcl-2 mRNA表達(dá)，減輕caspase3酶活性。第三部分實驗中活血化瘀中藥可以促進(jìn)靜息及活化脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖活性，降低靜息T細(xì)胞的自然凋亡率。增加地塞米松誘導(dǎo)6h后的T淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-2 mRNA表達(dá)。在活化誘導(dǎo)早期（6 h）促進(jìn)T淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-2 mRNA表達(dá)，在晚期（18 h）減少IL-2 mRNA表達(dá)。 結(jié)論:脾臟T淋

8、巴細(xì)胞的異常凋亡與膿毒癥免疫麻痹的發(fā)生相關(guān)，并受凋亡相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)。膿毒癥狀態(tài)下的高糖皮質(zhì)激素血癥及T淋巴細(xì)胞過度活化引起的AICD是脾臟T淋巴細(xì)胞異常凋亡的誘發(fā)因素，地塞米松誘導(dǎo)的凋亡受Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)，而AICD的發(fā)生與Fas、FasL、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的改變有關(guān)?；钛鲋兴幙赏ㄟ^調(diào)節(jié)IL-2 mRNA表達(dá)而減輕兩種因素誘導(dǎo)的脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡，同時可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖活性，減輕T細(xì)胞的自然