塞來(lái)昔布對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株作用及其機(jī)制的體外研究.pdf

1、急性早幼粒細(xì)胞性白血病是一種獨(dú)特的急性髓細(xì)胞性白血病亞型,具有特征性的t(15;17)染色體異位并表達(dá)融合基因PML/RARa.其病勢(shì)兇險(xiǎn),容易出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血而導(dǎo)致病人死亡.我國(guó)學(xué)者應(yīng)用全反式維甲酸和三氧化二砷分別通過(guò)誘導(dǎo)分化和誘導(dǎo)凋亡的方式使APL病人達(dá)到完全緩解,成為本病治療歷史上的里程碑.但是單用全反式維甲酸容易復(fù)發(fā),而且容易產(chǎn)生對(duì)維甲酸的耐藥;砷劑使用后的毒副反應(yīng)以及出現(xiàn)繼發(fā)腫瘤的可能仍然不利于病人的長(zhǎng)期生存,因此仍然需要

2、安全、有效、經(jīng)濟(jì)的治療方法和新的藥物.塞來(lái)昔布是一種磺胺類制劑的衍生物,是環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的選擇性抑制劑,在臨床上作為非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥物廣泛使用于各種骨關(guān)節(jié)疾病:如骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎.近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞均具有顯著的抗腫瘤作用<'[1-3]>,而對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤尤其是急性白血病的作用則鮮見(jiàn)于報(bào)道.本研究試圖研究塞來(lái)昔布對(duì)急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞的作用及其可能的相關(guān)機(jī)制

3、,研究分為三部分: 第一部：分塞來(lái)昔布抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用 本研究第一部分中首先采用MTT法分析塞來(lái)昔布對(duì)APL細(xì)胞株細(xì)胞NB4、MR2和原代APL細(xì)胞增殖的影響,并且以正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株:Eahy926為正常細(xì)胞對(duì)照.結(jié)果顯示:塞來(lái)昔布對(duì)APL細(xì)胞株和原代APL細(xì)胞均具有明顯的增殖抑制作用.隨著作用濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng),塞來(lái)昔布對(duì)NB4和MR2細(xì)胞增殖抑制率分別從

4、1.94﹪和3.28﹪提高到96.07﹪和93.55﹪,與對(duì)照比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).塞來(lái)昔布作用24h對(duì)NB4細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50﹪ inhibition concentration,1C50)為86.24μmol/L,而對(duì)MR2細(xì)胞為80.93μmol/L.對(duì)原代APL繃胞的24h增殖抑制率從1.35﹪提高到95﹪,經(jīng)計(jì)算IC50約為75-80pmol/L.而作用24h對(duì)正常對(duì)照的IC50約為930-12601gn

5、ol/L,已遠(yuǎn)大于塞來(lái)昔布的臨床允許使用劑量.同時(shí)以臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞并繪制生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布明顯抑制細(xì)胞增殖,抑制作用隨時(shí)間延長(zhǎng)和濃度增加而增加(P<0.01).同時(shí)為研究塞來(lái)昔布與As<,2>O<,3>是否存在協(xié)同作用,研究中以塞來(lái)昔布與As<,2>O<,3>聯(lián)合處理MR2細(xì)胞24h,MTT法測(cè)定對(duì)細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),與兩藥分別單用相比,未提示兩藥聯(lián)用存在明顯的協(xié)同作用.為了進(jìn)一步探討塞來(lái)昔布抑制APL細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

6、,我們從細(xì)胞凋亡的角度作了進(jìn)一步的研究.為了對(duì)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象進(jìn)行準(zhǔn)確地定性或定量分析,我們采用多種經(jīng)典、特異而敏感的實(shí)驗(yàn)指標(biāo),包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(光鏡及電鏡)、DNA片段化分析,并利用近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的流式細(xì)胞分析技術(shù)研究了細(xì)胞DNA含量和細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)轉(zhuǎn)位.結(jié)果顯示,形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn),光鏡下塞來(lái)昔布處理后NB4和MR2細(xì)胞體積變小、變形,細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象.部分細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊

7、緣化,分割成塊狀.電鏡提示細(xì)胞體積變小,胞膜結(jié)構(gòu)保持完整,胞核固縮,染色質(zhì)濃縮邊集,形成新月形胞核.瓊脂糖凝膠電泳DNA片段化分析示120-1601amol/L塞來(lái)昔布作用24h,NB4和MR2細(xì)胞均可見(jiàn)基因組DNA降解,并出現(xiàn)典型的DNA梯形條帶.在流式細(xì)胞儀上可檢測(cè)到亞二倍體峰;進(jìn)一步采用AnnexinV-PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果顯示:NB4細(xì)胞經(jīng)40-160μmol/L塞來(lái)昔布作用24h,早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為11.00

8、﹪、29.10﹪和39.30﹪,明顯高于空白對(duì)照組2.60﹪(P<0.01);MR2細(xì)胞經(jīng)20-160μmol/L塞來(lái)昔布作用24h,早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為9.59﹪、24.00﹪和36.10﹪,也明顯高于空白對(duì)照細(xì)2.84﹪(P<0.01). 第二部分：塞來(lái)昔布誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制研究 在本研究第二部分中,為進(jìn)一步研究探討塞來(lái)昔布誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制和相關(guān)途徑,首先用Western-blot

9、檢測(cè)塞來(lái)昔布處理后,NB4和MR2細(xì)胞caLSpaLSe-8,-9,-3和PARP蛋白的活性變化.結(jié)果顯示塞來(lái)昔布(80-1601amol/L)作用24h,可見(jiàn)明顯的caspase-9,-3和PARP蛋白的原始帶表達(dá)降低,伴有激活帶出現(xiàn),但是caspase-8的蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化.其次以流式細(xì)胞儀檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)NB4和MR2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布作用24h后,G<,0>/G<,1>細(xì)胞下降而S+G<,2>/M期細(xì)胞比例增加,

10、即細(xì)胞周期出現(xiàn)G<,1>/S期阻滯,與對(duì)照比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).同時(shí)用Western-blot檢測(cè)周期蛋白CyclinDl、CyclinE、P21<'waf/cipl>、P27<'KIP>、P16<'INK4a>的表達(dá),提示CyclinD1、CyclinE蛋白表達(dá)下降,而P21<'waf/cipl>、P27<'KIP>、P16<'INK4a>表達(dá)出現(xiàn)增高,與空白對(duì)照比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05). 另外以K56

11、2細(xì)胞作為細(xì)胞對(duì)照,并以As<,2>O<,3>為藥物對(duì)照,以RT-PCR檢測(cè)了融合基因PML/RARα的表達(dá)情況,結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度塞來(lái)昔布作用24h后,以β-actin作為內(nèi)參照,NB4和MR2細(xì)胞融合基因.PML/RARα的mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯改變(P>0.05).以RT-PCR檢測(cè)了NB4和MR2細(xì)胞內(nèi)和凋亡蛋白抑制因子家族Survivin、CIAP1、CIAP2和bcl-2/bax的mRNA表達(dá),而凋亡蛋白抑制因子家族中Surv

12、ivin的基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào),伴有CIAP2和bcl-2/bax的mRNA表達(dá)的下調(diào),而CIAP1基因的表達(dá)無(wú)明顯改變.同時(shí)以RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞COX-2基因表達(dá),以高表達(dá)COX-2基因的人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照,結(jié)果提示,NB4和MR2細(xì)胞中本身COX-2表達(dá)量較低或幾乎不表達(dá),塞來(lái)昔布作用前后COX-2的表達(dá)無(wú)明顯變化. 進(jìn)一步檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響.首先用RT-PCR方法檢測(cè)了塞來(lái)昔布處理后N

13、B4和MR2細(xì)胞VEGF基因表達(dá)水平的變化,發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布(80-160μmol/L)顯著抑制VEGF基因表達(dá).用Western-blot檢測(cè)VEGF蛋白,也發(fā)現(xiàn)VEGF蛋白表達(dá)下降. 第三部分塞來(lái)昔布對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞端粒酶活性的影響及相關(guān)機(jī)制研究 第三部分則主要研究塞來(lái)昔布對(duì)NB4和MR2細(xì)胞端粒酶活性的影響以及對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響.以PCR-ELISA檢測(cè)細(xì)胞端粒酶活性,提示塞來(lái)昔布作用后,NB4和MR2細(xì)

14、胞端粒酶活性下降,而且隨著藥物濃度的加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng),端粒酶活性受抑制的趨勢(shì)增強(qiáng),說(shuō)明塞來(lái)昔布對(duì)端粒酶活性的抑制具有劑量和時(shí)間依賴性,與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).其次以RT-PCR檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)NB4細(xì)胞和MR2細(xì)胞hTERT的mRNA表達(dá)的影響.與細(xì)胞端粒酶活性變化一致,塞來(lái)昔布作用24h后引起hTERT基因表達(dá)下調(diào),并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系.另外以RT-PCR檢測(cè)塞來(lái)昔布作用后,細(xì)胞內(nèi)的c-myc基因的表達(dá)情況,結(jié)果提

15、示細(xì)胞內(nèi)c-myc基因表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào). 進(jìn)一步研究了塞來(lái)昔布對(duì)APL細(xì)胞Akt/PKB途徑的影響,western-blot檢測(cè)提示塞來(lái)昔布作用24h后,隨著藥物濃度(80-160μmol/L)的增加,APL細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化受到抑制,表現(xiàn)為p-Akt的降低和非磷酸化Akt的增高. 綜上所述,本研究目前得出結(jié)論如下:(1)塞來(lái)昔布可直接抑制APL細(xì)胞株NB4、MR2細(xì)胞和原代APL細(xì)胞的生長(zhǎng),具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性;

16、但是對(duì)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株Eahy926細(xì)胞抑制作用較弱;(2)塞來(lái)昔布可使細(xì)胞周期受阻于G<,1>/S期,并下調(diào)周期蛋白CyclinD1、CyclinE,上調(diào)P21<'waf/cipl>、P27<'KIP>、P16<'INK4a>的表達(dá);(3)塞來(lái)昔布不但能直接殺傷APL細(xì)胞,還可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)VEGF水平;進(jìn)一步抑制細(xì)胞的生長(zhǎng);(4)一定濃度塞來(lái)昔布(80-160gmol/L)處理24h后可明顯地誘導(dǎo)APL細(xì)

17、胞凋亡,呈濃度依賴性; 隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),APL細(xì)胞凋亡率明顯增高,呈時(shí)間依賴性;(5)塞來(lái)昔布誘導(dǎo)NB4、MR2細(xì)胞凋亡伴有caspase.9,-3和PARP蛋白的激活;而caspase-8激活則不明顯;(6)塞來(lái)昔布的作用對(duì)融合基因PML/RARa表達(dá)無(wú)明顯影響:(7)塞來(lái)昔布對(duì)APL細(xì)胞內(nèi)COX-2的表達(dá)無(wú)明顯影響;(8)塞來(lái)昔布誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)CIAP2和survivin基因表達(dá)下調(diào),以及使bcl-2/bax基因比例下降;而對(duì)CIAP