新型PLA-BMG多孔復(fù)合生物活性材料的制備及相關(guān)研究.pdf

1、本文主要就新型PLA/BMG多孔復(fù)合生物活性材料的制備及相關(guān)進(jìn)行了研究，全文分以幾部分： 第一章 PLA/BMG多孔復(fù)合生物活性材料的制備及理化性質(zhì)檢測(cè) 目的：制備骨基質(zhì)明膠(BMG)，采用超臨界二氧化碳法與聚乳酸(PLA)復(fù)合制備PLA/BMG多孔復(fù)合生物活性骨植入材料，通過(guò)理化性能檢測(cè)選擇 PLA/BMG最佳復(fù)合比例，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。 方法：選取合格供體皮質(zhì)骨，按山西省醫(yī)用組織庫(kù)同種骨生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行冷凍

2、、清洗，粉碎后選擇粒徑大小為50 μm～200 gm的骨粉，將其進(jìn)行脫脂、脫鈣等處理制備成骨基質(zhì)明膠(BMG)；將PLA與BMG按體積比10：0、9：1、8：2，7：3，6：4進(jìn)行混勻，再加入粒徑為100 μm～200 μm的NaCl顆粒作為造孔劑(與復(fù)合材料的質(zhì)量比為3：1)，置于超臨界二氧化碳反應(yīng)裝置內(nèi)，將其密封后用液泵將冷凝到0℃以下的CO<,2>壓進(jìn)反應(yīng)釜內(nèi)，當(dāng)反應(yīng)釜內(nèi)壓力達(dá)到20 MPa時(shí)，開始升溫，使反應(yīng)釜內(nèi)溫度達(dá)到36℃，

3、調(diào)節(jié)釜內(nèi)的壓力和溫度，保持溫度變化不超過(guò)士0.5℃，壓力變化為±0.1 MPa。經(jīng)過(guò)30 min后，以5 MPa/min的速率放氣，打開反應(yīng)釜，取出樣品，去離子水浸瀝NaCl 48 h，冷凍干燥，包裝后進(jìn)行輻照滅菌備用。通過(guò)大體觀察、孔隙率測(cè)定，力學(xué)檢測(cè)、SEM觀察評(píng)價(jià)其理化性能，并結(jié)合體外細(xì)胞相容性檢測(cè)選擇最佳復(fù)合比例。 結(jié)論：采用SC-CO<,2>法制備的PLA/BMG多孔復(fù)合支架材料中BMG的比例與材料的孔隙率及細(xì)胞相容性

4、成正相關(guān)，與力學(xué)性能成負(fù)相關(guān)；含30％BMG的復(fù)合材料具有良好的綜合性能，為SC-CO<,2>法制備PLA/BMG的最佳復(fù)合比例。 第二章 PLA/BMG多孔復(fù)合材料生物相容性檢測(cè) 目的：采用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)所制備PLA/BMG多孔復(fù)合生物活性材料的組織生相容及細(xì)胞相容性，為PLA/BMG復(fù)合材料提供生物相容性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法：體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)：參照中華人民共和國(guó)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將所制備的P

5、LA/BMG復(fù)合材料、PLA材料按質(zhì)量與浸提液0.1 g/ml的比例，浸入不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的封閉容器內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱72 h，取出材料，將浸提液離心，取上清液并加入10％的胎牛血清；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞制備為1.5×10<'5>/ml細(xì)胞懸液，并接種于96孔培養(yǎng)板，單純DMEM高糖培養(yǎng)液組作陰性對(duì)照，不含細(xì)胞孔作為空白對(duì)照，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，按組別分別加入200 μl材料浸

6、提液，置37℃5％CO<,2>培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d更換浸提液一次。分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d后，每孔加入30 μl 2 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，每孔加入150 μl DMSO，振蕩使結(jié)晶物溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，測(cè)試波長(zhǎng)為570 nm，計(jì)算細(xì)胞增殖率并轉(zhuǎn)換為細(xì)胞毒性級(jí)。PLA/BMG復(fù)合材料細(xì)胞親和性測(cè)定：將PLA/BMG修剪成3 mm×3 mm×3 mm大小，放置于6孔培養(yǎng)板；傳

7、代至第3代的MC3T3-E1細(xì)胞以1×10<'4>/ml接種于已放置材料的培養(yǎng)板，加DMEM高糖培養(yǎng)基至完全淹沒材料，于接種后1、3、5天倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及與材料貼附情況，并于第5天取出材料，掃描電鏡觀察細(xì)胞貼附情況。生物相容性體內(nèi)評(píng)價(jià)：Wistar大鼠20只，無(wú)菌條件下，分別將PLA及PLA/BMG植于脊柱左、右側(cè)的皮下，及左右后肢的股肌袋內(nèi)，術(shù)后行大體觀察術(shù)后飲食、活動(dòng)、切口反應(yīng)等，于術(shù)后2、4、6、8周隨機(jī)處死5只動(dòng)物，

8、切取包括植入材料及周圍組織的復(fù)合組織塊，常規(guī)組織切片，HE染色，光鏡下觀察材料及周圍組織的組織學(xué)變化。 結(jié)論：SC-CO<,2>法制備的PLA/BMG復(fù)合材料對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞有較好的細(xì)胞親和性，細(xì)胞毒性級(jí)別為0級(jí)，具有良好的細(xì)胞相容性；皮下及肌內(nèi)植入均顯示PLA/BMG復(fù)合材料較單純PLA材料具有更好的組織相容性。 第三章PLA/BMG多孔復(fù)合材料生物活性檢測(cè) 目的：體外將PLA/BMG復(fù)合材料與小鼠MC3

9、T3-E1成骨前體細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)鈣結(jié)節(jié)、鈣含量與ALP活性的測(cè)定，間接評(píng)價(jià)PLA/BMG多孔復(fù)合材料的骨誘導(dǎo)活性，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)分組：DMEM組為培養(yǎng)基對(duì)照組(不含任何材料)；PLA/BMG組為每孔加入100 μg粉碎的PLA/BMG復(fù)合材料；PLA組為每孔加入100μg粉碎的PLA；每組設(shè)6復(fù)孔。將小鼠MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞適當(dāng)傳代后，稀釋制成2×10<'6>/ml細(xì)胞懸浮液，每孔20μl接種

10、于含不同組別材料的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞粘壁后，分別加入1 ml含10 μmol/ml β-甘油磷酸及5 μg/ml抗壞血酸的DMEM高糖培養(yǎng)基。每3 d換液一次，每次換液量為培養(yǎng)液的2/3，培養(yǎng)2周后，消化收集細(xì)胞。鈣結(jié)節(jié)測(cè)定：PBS沖洗收集細(xì)胞后的培養(yǎng)板，福爾馬林溶液固定后，1％茜素紅溶液染色，倒置相差顯微鏡觀察，數(shù)碼相機(jī)拍攝每個(gè)培養(yǎng)孔圖像，圖像處理與分析軟件測(cè)定被染色面積占培養(yǎng)孔總面積的百分比，即為鈣化結(jié)節(jié)面積百分比。鈣含量及堿性磷

11、酸酶(ALP)活性測(cè)定：0.2％的NP-40重新懸浮收集細(xì)胞，在冰浴中超聲裂解，將細(xì)胞裂解液嚴(yán)格按照鈣含量及ALP活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行鈣含量及ALP活性的檢測(cè)。應(yīng)用方差分析和 Tamhane's T2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)論：采用SC-CO<,2>法制備的PLA/BMG多孔復(fù)合支架材料具有良好的骨誘導(dǎo)活性，好于單純PLA材料，有可能作為一種有前景的骨植入材料及骨組織工程支架材料。 第四章 PLA/BMG多孔復(fù)合材料

12、修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究 目的：建立兔橈骨節(jié)段性骨缺損模型并將PLA/BMG多孔復(fù)合材料植入，評(píng)價(jià)其修復(fù)節(jié)段性骨缺損的能力，為可能的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：選用新西蘭大白兔24只，腹腔麻醉后，無(wú)菌操作暴露橈骨中段，牙科鉆截取兔雙側(cè)橈骨中段，造成約12 mm骨缺損，按組別分別植入各組材料，于術(shù)后4 w、8 w、12 w分別取材，每次8只。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，骨缺損處不植入任何材料作為陰性對(duì)照；PLA材料組，

13、骨缺損處植入PLA材料；PLA/BMG復(fù)合材料組，骨缺損處植入PLA/BMG多孔復(fù)合材料；自體骨組，骨缺損處將截取的自體骨再植入骨缺損處，作為陽(yáng)性對(duì)照。X光檢查：動(dòng)物于取材時(shí)間，行橈骨正位X線片檢查，觀察不同時(shí)間點(diǎn)骨缺損愈合情況。根據(jù)Lane等的X線片評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組移植區(qū)骨形成、骨連接和骨塑形情況進(jìn)行評(píng)分，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。組織學(xué)觀察：截取橈骨植骨部位，有機(jī)樹脂包埋，用硬組織切片機(jī)制作厚度為5 μm切片標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察骨形