細(xì)胞因子GM-CSF、VEGF對(duì)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞功能活性的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的體外研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的多因素參與的動(dòng)態(tài)病理過(guò)程,眾多傳統(tǒng)的和非傳統(tǒng)的心血管疾病危險(xiǎn)因素所引起的血管內(nèi)皮損傷是病變的始動(dòng)階段,因此如何保持血管內(nèi)皮的完整性和功能活性對(duì)于延緩血栓形成、內(nèi)膜增生等病變尤為重要,進(jìn)而對(duì)于AS等心血管疾病的防治具有重要意義。
　　 近年來(lái),大量的研究表明,骨髓源性/組織特異性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPC

2、s)能夠被動(dòng)員,特異性歸巢于血管內(nèi)皮損傷部位,參與出生后血管動(dòng)態(tài)維持和生理性重建,以其高增殖、分化潛能使血管內(nèi)皮損傷后結(jié)構(gòu)和功能的快速恢復(fù)成為可能。
　　 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)不但是一種炎性因子,還能刺激干細(xì)胞的增殖和分化。并且有研究表明,循環(huán)EPCs數(shù)量與血中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothe

3、lial growthfactor,VEGF)水平呈正相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax、一氧化氮(nitric oxide,NO)都是其重要的下游因子。
　　 目前,關(guān)于GM-CSF對(duì)EPCs功能活性影響的研究較少,因此,本實(shí)驗(yàn)在體外分別分離培養(yǎng)大鼠骨髓和脾EPCs,來(lái)研究比較GM-CSF對(duì)兩種來(lái)源EPCs功能活性的影響。另外,在體外分別分離培養(yǎng)大鼠骨髓EPCs和大鼠心臟微

4、血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs),通過(guò)建立EPCs摻入CMECs的體外模型,從細(xì)胞、蛋白、基因水平來(lái)研究VEGF對(duì)EPCs功能活性的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而為探討血管再生修復(fù)機(jī)制及AS等缺血性疾病的防治提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 一、GM-CSF對(duì)大鼠骨髓和脾內(nèi)皮祖細(xì)胞功能活性的影響
　　 1、方法
　　 (1)EPCs的分離、培養(yǎng)、

5、純化及鑒定
　　 用密度梯度離心法分別分離培養(yǎng)大鼠骨髓和脾EPCs,用含低血清生長(zhǎng)補(bǔ)充物(low serum growth supplement,LSGS)的M200培養(yǎng)液培養(yǎng)。24h后,將培養(yǎng)液倒入另一個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。5d后首次換液,以后每2d換液一次。在倒置相差顯微鏡下觀察EPCs的形態(tài)特征和生長(zhǎng)分化過(guò)程。標(biāo)記FITC-AC133和PE-vWF鑒定EPCs,在熒光顯微鏡下觀察。選取培養(yǎng)7d的EPCs施加實(shí)驗(yàn)因素。

6、　　 (2)實(shí)驗(yàn)分組
　　 濃度效應(yīng)組:對(duì)照組(無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液),RatGM-CSF不同濃度組(25、50、100ng/ml),分別作用96h；相同濃度RatGM-CSF(100ng/ml)不同作用時(shí)間組(24、48、72、96h)。
　　 (3)EPCs增殖、遷移、管腔形成的檢測(cè)
　　 分別用MTT比色法、Transwell小室、Matrigel管腔形成的體外模型檢測(cè)RatGM-CSF對(duì)EPCs增殖、遷

7、移、管腔形成的影響。
　　 (4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s表示,用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、結(jié)果
　　 (1)EPCs的形態(tài)觀察及鑒定
　　 培養(yǎng)5d可見(jiàn)多個(gè)貼壁的細(xì)胞集落形成,集落中央為圓形細(xì)胞,由中央向外周伸展出梭形細(xì)胞,與胚胎發(fā)生時(shí)期的血島相似。培養(yǎng)7d時(shí),中央的圓形細(xì)胞漂浮,外周的梭形細(xì)胞繼續(xù)保持貼壁狀態(tài)

8、,生長(zhǎng)旺盛。培養(yǎng)14d時(shí),梭形細(xì)胞融合成內(nèi)皮細(xì)胞單層。AC133陽(yáng)性細(xì)胞被標(biāo)記上綠色熒光,vWF陽(yáng)性細(xì)胞被標(biāo)記上紅色熒光,雙重染色陽(yáng)性的細(xì)胞發(fā)黃色熒光,被認(rèn)為是正在分化中的EPCs。
　　 (2)GM-CSF對(duì)EPCs增殖、遷移、管腔形成的影響
　　 與對(duì)照組相比,RatGM-CSF作用后,EPCs的OD490值、遷移的細(xì)胞數(shù)、形成的管腔數(shù)明顯增加,并在一定范圍內(nèi)呈濃度及時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。
　　 二、ⅦGF對(duì)大鼠骨髓

9、內(nèi)皮祖細(xì)胞功能活性的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
　　 1、方法
　　 (1)EPCs的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定
　　 實(shí)驗(yàn)方法同論文一。
　　 (2)CMECs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 用酶消化法分離大鼠CMECs,用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察CMECs的形態(tài)特征和生長(zhǎng)過(guò)程。用SP法對(duì)CMECs進(jìn)行vWF免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,在光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 (3)實(shí)驗(yàn)分組

10、
　　 濃度效應(yīng)組:對(duì)照組(無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液),RatVEGF不同濃度組(10、25、50ng/ml),分別作用48h；相同濃度RatVEGF(50ng/ml)不同作用時(shí)間組(12、24、36、48h)。
　　 (4)建立EPCs摻入CMECs模型
　　 用2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarba midinedihy drochloride(DAPI)標(biāo)記EPCs,將EPCs和CM

11、ECs混合培養(yǎng),用Matrigel建立管腔形成的體外模型。
　　 (5)EPCs增殖、遷移、管腔形成的檢測(cè)
　　 分別用MTT比色法、Tanswell小室、Matrigel管腔形成的體外模型檢測(cè)EPCs增殖、遷移、管腔形成能力。實(shí)驗(yàn)方法同論文一。
　　 (6)EPCs凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax、整合素β2、內(nèi)源性VEGF表達(dá)的檢測(cè)
　　 用蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)EPCs

12、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax、整合素β2、內(nèi)源性VEOF的表達(dá)。
　　 (7)VEGF對(duì)EPCs PI3K/Akt→eNOS/NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的檢測(cè)
　　 ①eNOSmRNA和eNOS蛋白表達(dá)的檢測(cè)
　　 首先將EPCs分為對(duì)照組(無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液)、RatVEGF組(50ng/ml)、RatVEGF(50ng/ml)+PI3K抑制劑LY294002(50μM)組,分別作用1h和48h。然后分別用反轉(zhuǎn)錄聚合

13、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blotting檢測(cè)eNOSmRNA和eNOS蛋白的表達(dá)。
　　 ②eNOS抑制劑對(duì)EPCs功能活性影響的檢測(cè)
　　 首先將EPCs分為對(duì)照組(無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液)、RatVEGF組(50ng/ml)、RatVEGF(50ng/ml)+eNOS抑制劑L-NAME(10μM)組,分別

14、作用48h。然后分別用MTT比色法、Transwell小室、Matrigel管腔形成的體外模型檢測(cè)EPCs的增殖、遷移、管腔形成能力。實(shí)驗(yàn)方法同論文一。
　　 (8)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s表示,用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、結(jié)果
　　 (1)CMECs的形態(tài)觀察及鑒定
　　 CMECs大約在培養(yǎng)4h后貼壁。培養(yǎng)1

15、d時(shí),呈明顯的短梭形。培養(yǎng)7d時(shí),呈典型的“鋪路石”樣。vWF呈陽(yáng)性表達(dá)。
　　 (2)VEGF對(duì)EPCs摻入CMECs的影響
　　 與對(duì)照組相比,RatVEGF顯著增加EPCs摻入CMECs的數(shù)量,并在一定范圍內(nèi)呈濃度及時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。
　　 (3)VEGF對(duì)EPCs增殖、遷移、管腔形成的影響
　　 與對(duì)照組相比,RatVEGF作用后,EPCs的OD490值、遷移的細(xì)胞數(shù)、形成的管腔數(shù)明顯增加,并在一定范

16、圍內(nèi)呈濃度及時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。
　　 (4)VEGF對(duì)EPCs凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax、整合素β2、內(nèi)源性VEGF表達(dá)的影響
　　 與對(duì)照組相比,RatVEGF顯著上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、整合素β2、內(nèi)源性VEGF的表達(dá),下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá),并在一定范圍內(nèi)呈濃度及時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。
　　 (5)VEGF對(duì)EPCs PI3K/Akt→eNOS/NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響
　　 與對(duì)照組相比,RatV

17、EGF組eNOSmRNA和eNOS蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)；當(dāng)加入PI3K抑制劑LY294002后,與RatVEGF組相比,eNOSmRNA和eNOS蛋白的表達(dá)顯著降低。PI3K抑制劑LY294002能夠減弱RatVEGF所引起的eNOSmRNA和eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　 (6)eNOS/NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與VEGF促進(jìn)EPCs功能活性的關(guān)系
　　 與對(duì)照組相比,RatVEGF顯著增強(qiáng)EPCs的增殖、遷移、管腔形成能力；當(dāng)加

18、入eNOS抑制劑L-NAME后,與RatVEGF組相比,EPCs的功能活性顯著降低。eNOS抑制劑L-NAME能夠減弱RatVEGF對(duì)EPCs增殖、遷移、管腔形成等功能活性的促進(jìn)作用。
　　 結(jié) 論
　　 1、GM-CSF能夠顯著增強(qiáng)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓和脾EPCs的增殖、遷移、管腔形成能力,并在一定范圍內(nèi)呈濃度及時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。
　　 2、VEGF能夠顯著增加體外培養(yǎng)的大鼠骨髓EPCs摻入CMECs的數(shù)量,并在一定