靶向微管新結(jié)構(gòu)雙吲哚馬來(lái)酰亞胺化合物HD-ZWM-288抗腫瘤作用的研究.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)今危害人類(lèi)健康甚至危及生命的主要疾病之一，其發(fā)病率逐年上升。乳腺癌和肝癌都是十分常見(jiàn)的惡性腫瘤，因其具有易轉(zhuǎn)移并且易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，使得尋找毒性低同時(shí)療效好的新型化療藥物也成為目前腫瘤治療方面的一個(gè)重要的研究方向。中國(guó)海洋大學(xué)朱偉明課題組在從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性的新吲哚咔巴唑生物堿的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了對(duì)雙吲哚馬來(lái)酰亞胺類(lèi)生物堿結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系的研究工作，設(shè)計(jì)并合成了一系列雙吲哚馬來(lái)酰亞胺類(lèi)化合物，它們是一類(lèi)具有烷基和腈

2、基鏈的取代的結(jié)構(gòu)。我們的前期研究已表明這些化合物能夠抑制多株腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本文在發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288靶向微管的基礎(chǔ)上，深入研究了其微管介導(dǎo)的抗腫瘤作用機(jī)制。
　　在對(duì)化合物篩選中，我們發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288有抑制微管的作用。以MCF-7細(xì)胞株和MDA-MB-231細(xì)胞株為研究對(duì)象，MTT法檢測(cè)了HD-ZWM-288對(duì)它們的生長(zhǎng)抑制作用，并呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量的依賴(lài)性。我們建立了裸鼠皮下移植瘤模型，連續(xù)給藥兩周，結(jié)果表明HD-Z

3、WM-288體內(nèi)也能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。免疫熒光染色、Western Blot和免疫組化染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明，HD-ZWM-288在體內(nèi)和體外都具有抑制微管蛋白的作用。用流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)化合物處理后的細(xì)胞被阻滯在G2/M周期。延長(zhǎng)給藥時(shí)間，通過(guò)DAPI染色和AnnexinⅤ和PI雙染這些手段發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比加入了HD-ZWM-288后的細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)聚集和凋亡率增加，這些結(jié)果提示該化合物最終可能通過(guò)細(xì)胞凋亡的方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。綜上所述，HD-

4、ZWM-288抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，首先它抑制微管蛋白聚合，導(dǎo)致cdc2、p-cdc2蛋白表達(dá)下降，使細(xì)胞停滯于G2/M期，進(jìn)一步抑制增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　肝癌的發(fā)生與惡化與細(xì)胞本身的增殖、凋亡和分化三者之間達(dá)成的平衡失穩(wěn)息息相關(guān)。通過(guò)MTT法檢測(cè)的結(jié)果顯示HD-ZWM-288能夠抑制HepG-2細(xì)胞株的增殖。同樣建立裸鼠單側(cè)腋下皮下HepG-2移植瘤模型，結(jié)果證明在體內(nèi)它也能抑制HepG-2移植瘤生長(zhǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，

5、發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288可以誘導(dǎo)HepG-2凋亡并且使細(xì)胞停滯在G2/M期。采用DAPI染色同樣發(fā)現(xiàn)化合物處理細(xì)胞后出現(xiàn)典型的凋亡特點(diǎn)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明cyclinB1的蛋白表達(dá)水平增加，cdc2和p-cdc2的蛋白表達(dá)水平下降，進(jìn)一步證明G2/M期阻滯是由于HD-ZWM-288影響細(xì)胞的周期相關(guān)蛋白導(dǎo)致的。選用Western Blot檢測(cè)加藥后磷酸化H2AX的表達(dá)變化，表明化合物作用后出現(xiàn)了DNA雙鏈斷裂。在HD-

6、ZWM-288誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，我們還發(fā)現(xiàn)化合物作用于細(xì)胞后ROS的顯著增加，Bcl-2/Bax這兩者的蛋白表達(dá)率顯著降低，線粒體膜電勢(shì)崩潰和細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活了caspase-9，caspase-3和PARP這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。綜上所述，HD-ZWM-288首先造成HepG-2細(xì)胞DNA損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，無(wú)法修復(fù)損傷的細(xì)胞則啟動(dòng)了線粒體途徑的凋亡。
　　血管生成是腫瘤的發(fā)生、

7、生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移過(guò)程當(dāng)中必不可少的關(guān)鍵所在。MTT結(jié)果說(shuō)明HD-ZWM-288能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在較低劑量下，化合物對(duì)遷移和管形成有明顯的抑制作用。此外，還采用雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)和建立的裸鼠皮下移植瘤模型對(duì)化合物的抗新生血管作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。CAM和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明HD-ZWM-288在體內(nèi)也可以有效地發(fā)揮抑制血管生成的作用。在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上檢測(cè)了在血管形成中起到重要作用的分子和相關(guān)通路，結(jié)果表明HD-